雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架預防再狹窄的實驗研究.pdf

1、第一部分:雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架的制備及相關特性研究
　　目的
　　制備雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架，并對其機械性能、堅韌性、藥物釋放特點及生物相容性能進行檢測。
　　方法
　　1、采用層層靜電自組裝法制備殼聚糖/肝素/CD34(CS/HP/CD34)抗體涂層，然后通過噴涂法制備PLGA/雷帕霉素藥物涂層，最后進行支架組裝。
　　2、通過電鏡及光學顯微鏡觀察支架的物理性能，包括表面形貌，彎曲性

2、能，膨脹性能等，電鏡觀察涂層生物相容性，并對支架所載藥物進行體外釋放測定。
　　結果
　　1、成功制備雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架，并對其物理性能和所載藥物釋放特點進行評價，其各項觀察指標符合支架制備基本要求，彎曲、壓握及球囊擴張后涂層覆蓋均勻無開裂;通過電鏡觀察支架表面未見血小板聚集或偽足形成，涂層具有良好的生物相容性。
　　2、支架所載雷帕霉素釋放曲線呈線性釋放，一定程度克服了市面上同類支架爆發(fā)性釋放的特點，持

3、續(xù)觀察60d仍能檢測到藥物濃度。
　　結論
　　所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架符合冠脈植入支架制作工藝的基本要求，同時具備良好的物理性能及生物相容性，所載抗增殖藥物可持續(xù)線性釋放。
　　第二部分:雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架捕獲干細胞及其特性的研究
　　目的
　　在已對所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架機械性能、藥物釋放特點及生物相容性能研究基礎上，進一步對所設計支架捕獲內皮祖細胞能力及其所捕獲

4、內皮祖細胞的分化特征進行研究。
　　方法
　　1、通過掃描電鏡及間接免疫熒光觀察所制支架體外捕獲內皮祖細胞情況及其分化特征。
　　2、通過熒光顯微鏡觀察兔耳實驗捕獲內皮祖細胞情況及支架片段的內皮化程度。
　　結果
　　1、體外模擬內皮祖細胞捕獲實驗電鏡觀察:CD34抗體涂層可捕獲有直徑6-8μm左右的紡錘狀細胞，24h時細胞變得充盈飽滿。所捕獲細胞具有內皮祖細胞的外形特征。間接免疫熒光觀察CD34抗體支架表

5、面可見大量VEGFR-2陽性細胞黏附的紅色熒光斑點。
　　2、兔耳動脈內皮祖細胞捕獲實驗免疫熒光觀察見抗體涂層支架植入后24h支架大部分被血管內皮細胞所覆蓋，48h達到完全覆蓋，未見細胞異常聚集。
　　結論
　　1、所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架能特異性快速捕獲外周血液中的血管內皮祖細胞，其抗體與基礎涂層靜電結合牢固，具備良好的耐沖刷性能。
　　2、所制支架植入后48h即可完成血管內皮細胞覆蓋，實現(xiàn)了支架快

6、速內皮化，可促進內皮細胞修復。
　　第三部分:動物體內實驗評價雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架的有效性和安全性
　　目的
　　應用小型豬冠脈損傷模型考察雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架預防ISR的有效性和安全性。
　　方法
　　1、應用小型豬冠脈損傷模型將所制雷帕霉素支架(SES)、CD34抗體支架(GS)和雷帕霉素/CD34抗體支架(HCASES)分別隨機植入小型豬的左、右冠狀動脈，取術后1h，12h，2

7、4h，2d，3d，7d，14d，28d，2m靜脈血觀察藥代動力學特征。
　　2、14d，1m，3m，6m隨訪造影觀察支架輸送的性能，支架內血栓及再狹窄情況。
　　3、術后14d，1m時間點經(jīng)電鏡掃描觀察早期支架內皮覆蓋情況。
　　4、術后1m，3m，6m時間點通過病理形態(tài)學及半定量病理積分觀察內皮化程度，炎癥情況及內膜增生程度。
　　結果
　　1、各組支架具有良好的柔順性，X線下可視，全部實驗動物置入順利，

8、無意外死亡。SES及HCASES組支架雷帕霉素釋放藥物濃度在1.55-2.36ng/ml，2m時仍可檢測。
　　2、各組支架間早期內皮化程度存在差異，SES組支架內皮覆蓋程度弱于GS及HCASES組支架。在支架置入14d時，GS及HCASES組可見梭型內皮細胞覆蓋，相對排列規(guī)則，SES組內皮覆蓋不均勻，細胞間連接不緊密。1m時GS及HCASES組內皮細胞覆蓋完整，排列規(guī)則;SES組細胞輪廓不規(guī)整且細胞排列紊亂，見小圓形的炎癥細胞。

9、
　　3、病理切片形態(tài)學及計算機測量:在1m，3m，6m時間點SES及HCASES組較GS組管腔面積增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但SES組與HCASES組間LA差異不明顯(P＞0.05)。1m，3m，6m時間點觀察SES及HCASES組較GS組新生內膜面積及厚度均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但SES組與HCASES組間差異不明顯(P＞0.05)。同樣SES及HCASES組較GS組狹窄率降低，差異有統(tǒng)計學意義

10、(P＜0.05)，但SES組與HCASES組間狹窄率對比差異不明顯(P＞0.05)。
　　4、病理學積分半定量測量顯示:損傷積分中SES，GS及HCASES各組支架14d及1m時間點損傷積分無明顯差異，3m及6m時間點SES組損傷積分較GS組及HCASES組略高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。比較SES，GS及HCASES各組14d、1m、3m和6m時間點內皮化情況，支架植入后14d，1m時GS組及HCASES支架組內皮化分

11、數(shù)較SES支架組高，差異有統(tǒng)計學意義（P值＜0.05）;3m時間點觀察各組內皮化基本完全，GS組及HCASES支架組內皮化分數(shù)較SES支架組略高，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，6m時間點觀察各組內皮化完全，各組間內皮化程度無差異。炎癥積分情況:比較SES，GS及HCASES各組1m、3m和6m時間點支架周圍炎癥細胞浸潤情況可見植入后1m為炎癥反應最顯著時期，其中SES組炎癥反應最重，HCASES組次之，炎癥反應最輕為GS組，差異有統(tǒng)

12、計學意義(P＜0.05)。至3m及6m時間點觀察，三組間炎癥反應差異不顯著(P＞0.05)。
　　結論
　　1、通過小型豬冠脈損傷模型14d-6m隨訪評價所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復合支架的有效性和安全性可行。
　　2、各組支架間早期（14d及1m時）SES組支架內皮覆蓋程度弱于GS及HCASES組，3m各組間內皮覆蓋程度差異不顯著，6m時各組間內皮化分數(shù)無差異。
　　3、在1m，3m，6m時間點SES及HCA

13、SES組管腔面積大于GS組，SES及HCASES組新生內膜面積及厚度均低于GS組，SES及HCASES組狹窄率低于GS組。1m時SES組炎癥反應最嚴重，HCASES組次之，炎癥反應最輕為GS組，至3m及6m時三組間炎癥反應差異不顯著。
　　4、所制HCASES支架的殼聚糖/肝素/CD34抗體涂層能在植入后14d可完成內皮覆蓋，促進內皮細胞修復;PLGA/雷帕霉素涂層可以抑制增殖并降低炎性反應，無支架內再狹窄，生物相容性良好，為進一