M-,2--G-,i1α-融合蛋白在Sf9細胞中的表達及特異性藥物的篩選.pdf

1、毒蕈堿型乙酰膽堿受體(AChR)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的成員之一。分子生物學分型依據(jù)M受體克隆基因序列差異，分為而M1-M5五種亞型，分子量約51-66kD，由460-590個氨基酸殘基組成，由細胞外的N端七次跨過細胞膜至胞漿內(nèi)的C端，形成三個膜外環(huán)(01-02)和三個膜內(nèi)環(huán)(i1-i3)，其中N末端、C末端和i3環(huán)在不同亞型間的變異最大，且以i3環(huán)最為顯著，它在胞漿內(nèi)形成一個157-240個氨基酸的柱狀a螺旋結(jié)構(gòu)，目前普遍認為i

2、3環(huán)是M受體不同亞型發(fā)揮作用的關鍵部位。M受體廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織、心肌、平滑肌和各種腺體，與相應配體結(jié)合可與G蛋白偶聯(lián)引起細胞內(nèi)的一系列信號傳遞及生物化學反應，影響細胞的活動或功能，參與調(diào)節(jié)各種生理反應，同時還參與某些疾病的發(fā)生。 G蛋白(G protein)作為一種十分重要的信號分子，近年進展迅速，其分子量約為100kD，由α(39-46kD)、β(36kD)和γ(7-8kD)三種亞基構(gòu)成。其中，α亞基差別

3、最大，是功能亞基，每種G蛋白的α亞基都有獨特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，但都有一定的同源性。依據(jù)α亞基的不同將G蛋白分為Gs、Gi、Gq、G12/13四種類型。在G蛋白介導的跨膜信號中，GPCRs，G蛋白和效應蛋白是信號轉(zhuǎn)導通路中的三個基本成分，它們的結(jié)構(gòu)、功能及其在信號轉(zhuǎn)導中的作用正在被逐漸揭示。 分子生物學上將M受體分成兩組：其中M1受體、M3受體和M5受體歸為M1組，主要通過Gq/11作用于磷脂酰肌醇系統(tǒng)激活磷脂酶C(PLC)，生

4、成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DAG)；而M2受體和M4受體則歸為M2組，通過與Gi/G0偶聯(lián)抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)生成減少。 本研究采用分子生物學技術(shù)，可將M2AChR與G蛋白Gila亞單位的cDNAs進行重組，通過桿狀病毒表達系統(tǒng)在Sf9昆蟲細胞中表達M2-Gila融合蛋白，利用放射配體結(jié)合實驗檢測這種高效偶聯(lián)的融合蛋白的偶聯(lián)功能，可闡明M2AChR與G蛋白Gila亞單位相互作用

5、和信號轉(zhuǎn)導機制及影響因素，鑒別和尋找M2受體亞型特異性藥物。 材料與方法: 1、材料 人M2AChR與牛Gila的cDNAs(PEF-hm2，pGa28)，桿狀病毒載體質(zhì)粒pBacPAK9的cDNAs，乙酰膽堿(ACh)，阿托品(atropine)，氧化震顫素(oxotremorine)，檳榔堿(arecoline)、fangchinoline、levitimide及鳥苷5’-O-(3-硫代三磷酸)[guanos

6、ine-5’-O-(3-thiotriphosphate)，GTPγS]等均由日本東京大學醫(yī)學部腦研生化教研室芳賀教授惠贈；Sf9昆蟲細胞株受贈于北京大學生命科學院陳建國教授；TNM-FH昆蟲細胞培養(yǎng)基購于Sigma公司；胎牛血清購于TBD公司；[3H]QNB(L-quinuclidinyl benzilate，1.8PBq/mol)、[35S]GTPγS(guanosine-5'-O-(3-thiotriphosphate，40PBq

7、/mol)購于Amersham Pharmacia Biotech公司。 2、方法 通過PCR的方法分別擴增M2AChR與Gila的cDNAs，純化后經(jīng)第二次PCR進行連接，再次切膠、純化，酶切消化后連接到病毒載體中，轉(zhuǎn)染Sf9細胞，培養(yǎng)48小時后收獲細胞，提取病毒和細胞沉淀。從細胞沉淀中經(jīng)消化、研磨、離心方法提取M2AChR-Gila融合膜蛋白，-70℃凍存?zhèn)溆?。融合蛋白?jīng)BCA方法初測含量后，進行[3H]QNB和[3

8、5S]GTPγS結(jié)合實驗檢測M2-Gila融合蛋白的功能并篩選M2受體的特異性配體。 結(jié)果: M2AChR與Gila的cDNAs分別擴增連接后插入到病毒載體中，并在Sf9細胞中成功表達。接種病毒后的Sf9細胞，細胞腫脹變大，大小不均，細胞內(nèi)顆粒增多，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后收獲細胞，提取病毒和細胞沉淀。從細胞沉淀中經(jīng)消化、研磨、離心方法提取膜蛋白，BCA方法測定膜蛋白含量為1.68mg/ml，[3H]QNB放射配體飽和實驗結(jié)果

9、，M2-G11α融合蛋白與[3H]]QNB特異性的、高水平的結(jié)合位點，隨著[3H]QNB濃度的升高，融合蛋白與[3H]QNB的結(jié)合量增加，具有M受體的特性，可用于檢測M2與Gi1α相互作用和信號轉(zhuǎn)導機制及影響因素的研究。[35S]GTPγS結(jié)合實驗檢測，乙酰膽堿(ACh)、氧化震顫素(oxotremorine)、檳榔堿(arecoline)為M2受體的激動劑，阿托品(atropine)、fangchinoline、levitimide為

10、M2受體的拮抗劑。 討論: 分子生物學方法的廣泛應用，為研究M受體亞型及信號轉(zhuǎn)導提供了新的途徑。本研究以高效偶聯(lián)的M2AChR-G11α融合蛋白為研究對象，檢測在配體作用下，M2AChR-G11α融合蛋白的表達和功能的變化，探討信號轉(zhuǎn)導中分子間相互作用的機制和影響因素，篩選M2受體亞型特異性藥物。 配體調(diào)節(jié)的GTPγS與G蛋白的結(jié)合是研究M受體與G蛋白偶聯(lián)的敏感方法。在GDP替代[35S]GTPγS結(jié)合實驗中，在

11、不同M受體配體、不同濃度GDP存在時，[35S]GTPγS競爭性結(jié)合作用的變化表明不同配體可以引起替代結(jié)合曲線偏移的方向和幅度不同，這種偏移代表了M2-G11α融合蛋白中的Gi1α與GDP親和力的大小，GDP與Gi1α的親和力越低，M2催化GDP由Ga上解離下來的能力越低，即激動劑作用時親和力減小，拮抗劑則使親和力增強。當與完全激動劑結(jié)合時，M2-Gi1α融合蛋白與GDP的親和力最低，與部分激動劑結(jié)合時次之，與拮抗劑結(jié)合時最強。因此，通

12、過分析GDP與M2-G11α融合蛋白親和力的大小可以篩選和鑒定M2受體未知的特異性完全激動劑、部分激動劑和拮抗劑。 M2-G11α融合蛋白成功表達為研究M2真受體后信號轉(zhuǎn)導機制提供了便利條件，同時也為篩選M2受體亞型特異性配體提供了可能性，為M2受體亞型特異性新藥開發(fā)和研制提供了有力的實驗手段。 結(jié)論: 桿狀病毒—Sf9細胞系統(tǒng)表達的M2-G11a融合蛋白具有與配體結(jié)合的特性及組分間偶聯(lián)的能力，配體通過改變M2-