人偏肺病毒結(jié)構(gòu)蛋白N、F在三種不同系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、人偏肺病毒human metapneumovirus，簡(jiǎn)稱hMPV，是荷蘭學(xué)者VandenHoogen等于2001年從患急性呼吸道感染的嬰幼兒臨床標(biāo)本中首次分離鑒定出的一種新病毒，它與禽類肺病毒(APV)的C型有較高的同源性，已歸屬于副粘病毒科肺病毒亞科。其全基因組除了一部分終止序列未明外已克隆成功。hMPV基因組為負(fù)鏈RNA病毒，包括8個(gè)基因和9個(gè)開(kāi)放閱讀框架。基因組編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白有核蛋白(nucleoprotein，N)、基質(zhì)蛋

2、白(matrixprotein，M)、融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn))、附著蛋白(attachmentglycoprotein，G)，其中F和G蛋白均為糖蛋白。另外還有磷蛋白P、22K蛋白M2和M2.2、小疏水蛋白SH、大多聚酶蛋白L。各蛋白基因組排列模式為3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。目前的研究認(rèn)為hMPV可能是一種常見(jiàn)的呼吸道感染病毒，在呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒陰性的呼吸道感染標(biāo)本中其檢出率可

3、達(dá)10％，在上或下呼吸道甚至上下呼吸道中均有檢出，兒童和成人均有感染，尤其是早產(chǎn)兒、老人及有免疫缺陷的患者更易患hMPV感染。hMPV作為新發(fā)現(xiàn)的人類急性呼吸道感染的病毒已越來(lái)越受到人們的重視。
　　 當(dāng)前hMPV的診斷只限于實(shí)驗(yàn)研究，由于用作病毒培養(yǎng)的常用細(xì)胞系不支持hMPV的復(fù)制，hMPV生長(zhǎng)緩慢、病變不典型且其在體外復(fù)制需要依賴胰酶，故采用通常的臨床病毒學(xué)方法很難鑒定hMPV。現(xiàn)在主要依賴于RT-PCR檢測(cè)病毒的RNA對(duì)它

4、進(jìn)行研究。要對(duì)hMPV進(jìn)行深入研究并弄清它在我國(guó)各年齡組人群中的感染狀況急需病毒分離株或特異性抗原，但由于人類偏肺病毒不出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，在組織培養(yǎng)中分離十分困難，通過(guò)分子生物學(xué)手段獲得特異性抗原用于研究就成為可行之路。
　　 本研究組已經(jīng)獲得了北京地區(qū)hMPV基因序列，在試圖分離病毒株的同時(shí)，嘗試運(yùn)用不同的表達(dá)系統(tǒng)(細(xì)菌，酵母，昆蟲(chóng))對(duì)人偏肺病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白(N，F(xiàn))進(jìn)行了表達(dá)。之所以選擇N和F蛋白，是因?yàn)镹蛋白(nucl

5、eoprotein 1182bp，394aa)是核蛋白，氨基酸序列最保守，在不同的基因型別的病毒間差異最小。而F蛋白(fusionprotein，1620bp，539aa)是一個(gè)糖蛋白，文獻(xiàn)報(bào)道它是hMPV最主要的能引起中和保護(hù)性抗體的抗原。
　　 實(shí)施課題的第一階段:為了便于蛋白純化，在蛋白的N端加入了一個(gè)6His標(biāo)簽和相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了重組pBh1887N(K)質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體系)和重組pFh1887N質(zhì)粒

6、(用于Bac-to-Bac體系)，測(cè)序均正確。雖然昆蟲(chóng)Bac-N-blu體系中感染昆蟲(chóng)細(xì)胞所收獲的上清進(jìn)行藍(lán)蝕班篩選，出現(xiàn)了藍(lán)斑；昆蟲(chóng)Bac-to-Bac體系中感染昆蟲(chóng)細(xì)胞所收獲的上清進(jìn)行PCR鑒定有目的基因的插入都說(shuō)明桿狀病毒中有目的基因的插入，但是對(duì)感染72小時(shí)收獲的昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot(分別用His抗體和hMPVN蛋白特異性抗體檢測(cè))，在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白

7、表達(dá)，Westernblot也沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白。
　　 實(shí)施課題的第二階段:考慮是否該N端his標(biāo)簽阻礙了蛋白的表達(dá)。嘗試變換標(biāo)簽的位置到蛋白的C端，并嘗試在多體系中表達(dá)。構(gòu)建了重組pB1887N質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體系)，重組pF1887Nh質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系)，單拷貝/雙拷貝的pAOα1887Nh重組質(zhì)粒(用于酵母表達(dá)系統(tǒng))，pET1887Nh重組質(zhì)粒(用于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng))，測(cè)序均正確。前兩個(gè)昆蟲(chóng)表達(dá)

8、體系在收獲了感染72小時(shí)后的昆蟲(chóng)細(xì)胞后，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot(分別用His抗體和hMPVN蛋白特異性抗體檢測(cè))。在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達(dá)，Westernblot可以檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)無(wú)論單雙拷貝，培養(yǎng)基上清雖然在SDS-PAGE上可見(jiàn)到43Kd處有蛋白出現(xiàn)，且不同克窿、菌株相對(duì)于對(duì)照載體菌表達(dá)的量不一樣，但是進(jìn)行Westernblot使用his抗體和特異性抗體

9、卻沒(méi)有檢測(cè)出目的蛋白。通過(guò)PCR可以鑒定到酵母基因組中已同源重組入目的基因。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)有較好的表達(dá)并能通過(guò)Westernblot(分別用His抗體和hMPVN蛋白特異性抗體檢測(cè))鑒定目的蛋白表達(dá)。
　　 實(shí)施課題的第三階段:在N蛋白嘗試表達(dá)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了重組pB1816F質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體)，重組pF1816Nh質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系)，測(cè)序均正確。Bac-to-Bac體系所收獲的感染72小時(shí)后的昆蟲(chóng)

10、細(xì)胞裂解液，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot(分別用His抗體和hMPVF蛋白特異性抗體檢測(cè))。在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達(dá)，WesternblotHis抗體未檢測(cè)到目的蛋白，而F蛋白特異性抗體檢測(cè)在60kD可看到條帶出現(xiàn)。Bac-N-blu體系所收獲的感染72小時(shí)后的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液得到藍(lán)蝕斑。
　　 實(shí)施課題的第四階段:選擇昆蟲(chóng)體系陽(yáng)性重組病毒(N蛋白)，擴(kuò)大感染規(guī)模，his標(biāo)簽純

11、化N蛋白，進(jìn)行臨床血清學(xué)的調(diào)查鑒定，并同細(xì)菌表達(dá)的N蛋白測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，正在進(jìn)行中。
　　 綜合以上結(jié)果說(shuō)明:偏肺病毒蛋白在不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)難易不同，N蛋白在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中最易表達(dá)，但F蛋白表達(dá)受阻，可能跟其具有一定毒性，結(jié)構(gòu)復(fù)雜有關(guān)；酵母體系有可能對(duì)N蛋白有修飾作用，使其無(wú)法被特異的短肽抗體所識(shí)別，F(xiàn)蛋白在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)即受阻，無(wú)法同前導(dǎo)肽相連；昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)對(duì)N，F(xiàn)蛋白均可以表達(dá)，但表達(dá)的量較低，有可能同初期重組病毒

12、滴度低有關(guān)，而且昆蟲(chóng)細(xì)胞的狀態(tài)好壞對(duì)蛋白表達(dá)影響較大，優(yōu)化不易。在表達(dá)N蛋白時(shí)，構(gòu)建了N端his標(biāo)簽和C端his標(biāo)簽的兩種重組質(zhì)粒，前者沒(méi)有表達(dá)而后者順利表達(dá)，測(cè)序結(jié)果均正確，無(wú)讀碼框的移位，提示his標(biāo)簽對(duì)N蛋白表達(dá)產(chǎn)生了阻扼作用，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析考慮應(yīng)是在轉(zhuǎn)錄的mRNA起始處產(chǎn)生復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響了翻譯的進(jìn)行，需要在以后蛋白的表達(dá)中注意。
　　 通過(guò)研究各表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)hMPV病毒蛋白，以期能夠找到一種理想的表達(dá)體系，所表達(dá)的病