CACNA2D1的糖基化修飾與胃癌多藥耐藥的發(fā)生.pdf

1、胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，2012年有951600例新發(fā)胃癌病例，胃癌死亡病例則高達(dá)723100例。隨著醫(yī)學(xué)治療相關(guān)研究的發(fā)展，化療藥物對(duì)胃癌的治療效果越來越顯著，但胃癌的多藥耐藥現(xiàn)象成為影響胃癌患者治療效果的重要難題。
　　為了解決胃癌多藥耐藥導(dǎo)致的治療難題，研究人員進(jìn)行了大量的研究。本實(shí)驗(yàn)室也正在開展一系列更加深入的研究工作。目前我們已建立了多株胃癌耐藥細(xì)胞亞系，并應(yīng)用糖蛋白組學(xué)鑒定和lncRNA芯片,成功篩

2、選鑒定出一系列耐藥相關(guān)基因和分子。因?yàn)槲赴┑亩嗨幠退帣C(jī)制十分復(fù)雜，我們篩選出的耐藥相關(guān)基因和分子不能完全闡明胃癌多藥耐藥發(fā)生發(fā)展的過程。
　　正確的糖基化修飾方式是維持蛋白質(zhì)正常生物活性的基礎(chǔ)，糖基化修飾錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致糖蛋白的合成減少或功能喪失。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道在多種腫瘤中糖基化修飾在多藥耐藥發(fā)生過程中扮演了重要角色。近期，越來越多的研究人員將目光聚焦于糖蛋白對(duì)腫瘤的影響，因此我們選取多株胃癌耐藥系，通過糖蛋白捕獲策略鑒定出11個(gè)表達(dá)

3、差異明顯的糖蛋白。這些糖蛋白很可能是預(yù)測(cè)胃癌多藥耐藥的生物標(biāo)志物或者具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。CACNA2D1是表達(dá)差異最明顯的糖蛋白之一。查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)CACNA2D1主要在神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用，目前關(guān)于CACNA2D1分子及其糖基化在胃癌多藥耐藥中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道，我們將在本研究中對(duì)CACNA2D1的糖基化修飾與胃癌多藥耐藥的關(guān)系進(jìn)行初步探討。
　　目的：
　　明確CACNA2D1在胃癌組織內(nèi)表達(dá)及與臨床預(yù)后的

4、關(guān)系；探討CACNA2D1表達(dá)變化對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥的作用及相關(guān)機(jī)制；研究糖基化修飾改變對(duì)CACNA2D1調(diào)節(jié)胃癌耐藥功能的影響，最終初步闡明CACNA2D1作為糖蛋白參與調(diào)節(jié)胃癌多藥耐藥惡性表型的作用路徑。
　　方法：
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)CACNA2D1在胃癌組織內(nèi)的表達(dá)，并采用Kaplan-Meier方法分析CACNA2D1與胃癌患者臨床預(yù)后之間的聯(lián)系。
　　2.qRT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C

5、ACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞系及其親本細(xì)胞系的表達(dá)。
　　3.擴(kuò)增和鑒定CACNA2D1正義和反義載體，并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過MTT方法、凋亡實(shí)驗(yàn)和藥物泵出實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACNA2D1表達(dá)改變后，對(duì)細(xì)胞功能的影響。
　　4.擴(kuò)增和鑒定CACNA2D1的糖基化位點(diǎn)突變載體，并建立相關(guān)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過MTT和藥物泵出實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖基化位點(diǎn)改變后，CACNA2D1的功能影響是否改變。
　　結(jié)果：
　　1、CACNA2D1在胃癌

6、組織中高表達(dá)與胃癌病人的預(yù)后密切相關(guān)
　　qRT-PCR檢測(cè)了16對(duì)新鮮胃癌組織及配對(duì)的癌旁組織，發(fā)現(xiàn)CACNA2D1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。同時(shí)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)CACNA2D1在89例胃癌和癌旁組織內(nèi)表達(dá)，結(jié)果顯示CACNA2D1在43例胃癌組織中呈陽性表達(dá)，表達(dá)陽性率為48.3％，明顯高于配對(duì)的癌旁組織的表達(dá)陽性率13.4%(12/89)。統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素分析發(fā)現(xiàn)CACNA2D1與胃癌患者臨床預(yù)后存在聯(lián)系，CACNA

7、2D1表達(dá)陽性的胃癌患者生存期較短。(p＜0.05）
　　2、CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)升高
　　我們通過qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和其親本細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在胃癌耐藥細(xì)胞系中，CACNA2D1的表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞中，CACNA2

8、D1的糖基化修飾程度要高于親本細(xì)胞中。
　　3、CACNA2D1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的耐藥
　　我們通過MTT檢測(cè)細(xì)胞IC50發(fā)現(xiàn)在胃癌耐藥細(xì)胞系中降低CACNA2D1的表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)ADR、5-fu和CDDP等化療藥物的敏感性均明顯上升；而上調(diào)親本細(xì)胞系中CACNA2D1的表達(dá)則可以顯著降低胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
　　流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，胃癌耐藥細(xì)胞系中 CACNA2D1表達(dá)下調(diào)后，凋亡細(xì)胞明顯增多，提

9、示下調(diào)CACNA2D1可以增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)5-fu的藥物敏感性；反之，在親本細(xì)胞系中上調(diào)CACNA2D1表達(dá)則可以降低胃癌細(xì)胞對(duì)5-fu的藥物敏感性。
　　同樣，藥物泵出實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制CACNA2D1的表達(dá)后耐藥細(xì)胞藥物泵出能力減弱；而上調(diào)CACNA2D1，胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素泵出能力明顯下降。
　　4、CACNA2D1的糖基化修飾可以促進(jìn)胃癌多藥耐藥
　　通過基因定點(diǎn)突變我們成功構(gòu)建了CACNA2D1糖基化位點(diǎn)突變載體

10、并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變的CACNA2D1蛋白對(duì)藥物的耐受能力明顯低于野生型的CACNA2D1蛋白；藥物泵出實(shí)驗(yàn)顯示，突變的CACNA2D1蛋白藥物泵出能力減弱。
　　結(jié)論：
　　1、在配對(duì)的胃癌癌旁組織中，CACNA2D1在胃癌組織的表達(dá)水平及強(qiáng)度明顯高于癌旁組織；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示CACNA2D1與胃癌患者生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)聯(lián)系。
　　2、CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞，且以高糖