Survivin在GM-CSF-G-CSF誘導(dǎo)的抗中性粒細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、中性粒細(xì)胞是外周血循環(huán)和免疫系統(tǒng)中最豐富的白細(xì)胞，它具有很短的半衰期，很快經(jīng)歷自發(fā)性凋亡以利于正常細(xì)胞的周轉(zhuǎn)和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimlating factor，GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimlating factor，G-CSF)是造血系統(tǒng)中重要的炎性細(xì)胞因子，它們能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖、分化

2、，并能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟。它們均能夠通過延遲細(xì)胞凋亡而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的存活、從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的功能。已有研究表明上述炎性細(xì)胞因子的抗中性粒細(xì)胞凋亡作用與Bcl-2蛋白家族成員，如Mcl-1，Al，和Bax等，以及凋亡蛋白抑制劑(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族成員，如cIAP-2的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。然而具體的機(jī)制仍不十分清楚。 Survivin是一種新近發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)獨(dú)特的IAPs成員。

3、到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)人類survivin存在5種不同的剪接異構(gòu)體。它們似乎具有獨(dú)特的亞細(xì)胞定位和不同的凋亡調(diào)節(jié)功能。大量的研究顯示，survivin在絕大多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，而且與病人不良的預(yù)后和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，已有的針對(duì)survivin的反義核酸、RNA干擾、負(fù)顯性突變等研究取得了一定的抗腫瘤治療效果。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，survivin在正常成人細(xì)胞中也有表達(dá)，可能參與正常細(xì)胞的增殖與存活。最近發(fā)現(xiàn)，survivin在從

4、囊性纖維化病人分離得到的終末分化的中性粒細(xì)胞中有較高的表達(dá)。此研究還發(fā)現(xiàn)，survivin在正常中性粒細(xì)胞中的表達(dá)能夠被GM-CSF和G-CSF所誘導(dǎo)，并且應(yīng)用反義寡核苷酸打靶中性粒細(xì)胞的survivin，能夠取消細(xì)胞因子的抗凋亡作用。這些結(jié)果表明，survivin在中性粒細(xì)胞中可能以未知的機(jī)制參與細(xì)胞因子的細(xì)胞保護(hù)作用。本試驗(yàn)欲研究凋亡蛋白抑制劑家族成員survivin在GM-CSF/G-CSF誘導(dǎo)的抗中性粒細(xì)胞凋亡中所發(fā)揮的作用及相

5、關(guān)的機(jī)制，從而為人們進(jìn)一步研究中性粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。 方法： 在本實(shí)驗(yàn)中，我們分別應(yīng)用了人類早幼粒白血病細(xì)胞株HL60以及新鮮分離的正常人外周血中性粒細(xì)胞。對(duì)于HL60細(xì)胞，我們分別應(yīng)用全反式維甲酸(ATRA)和佛波酯(PMA)進(jìn)行中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。根據(jù)需要給予誘導(dǎo)分化的HL60細(xì)胞以及正常的中性粒細(xì)胞一定濃度的GM-CSF或G-CSF處理。Survivin mRNA在不同細(xì)胞的表

6、達(dá)水平，通過實(shí)時(shí)定量PCR SYBR Green法來檢測(cè)；Survivin蛋白質(zhì)的表達(dá)，應(yīng)用多克隆兔抗人survivin抗體通過Western Blotting法來檢測(cè)；此外，我們還應(yīng)用Annexin V-FITC/PI染色、流式細(xì)胞術(shù)分析中性粒細(xì)胞的凋亡情況。最后，我們應(yīng)用雙脫氧末端終止測(cè)序法對(duì)HL60細(xì)胞和正常人中性粒細(xì)胞表達(dá)的survivin異構(gòu)體的序列進(jìn)行了測(cè)定。 結(jié)果： 隨著ATRA和PMA的誘導(dǎo)分化，HL60

7、細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)水平明顯降低。在誘導(dǎo)分化的第4天，survivin mRNA的水平均降低至不到原先水平的1％。相應(yīng)地，原先高表達(dá)的survivin蛋白，在誘導(dǎo)分化第4天時(shí)變得檢測(cè)不到。在ATRA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化過程中，給予10 ng/mL的GM-CSF處理，survivin的表達(dá)水平與未處理組相比明顯增加。對(duì)于已分化的中性粒細(xì)胞樣HL60細(xì)胞，GM-CSF能重新誘導(dǎo)survivin的表達(dá)，并且此作用具有時(shí)間和劑

8、量的依賴性，在1ng/mL的GM-CSF處理24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上，獲得最高的survivin表達(dá)。與此不同的是GM-CSF未能增加PMA誘導(dǎo)分化過程中HL60細(xì)胞survivin的表達(dá)。然而與HL60細(xì)胞不同，終末分化的正常人中性粒細(xì)胞，在無細(xì)胞因子培養(yǎng)24小時(shí)的條件下，survivin mRNA的水平自發(fā)性增加了6倍。而10 ng/mL，50 ng/mL的GM-CSF和25 ng/mL的G-CSF未能引起survivin mRNA水平的

9、進(jìn)一步增加。無細(xì)胞因子處理組與細(xì)胞因子處理組之間survivin mRNA的表達(dá)水平無顯著性差異。雖然沒能誘導(dǎo)survivin的表達(dá)，GM-CSF/G-CSF仍然發(fā)揮著抗中性粒細(xì)胞凋亡的作用。在培養(yǎng)了6小時(shí)和24小時(shí)的中性粒細(xì)胞中，GM-CSF/G-CSF能夠分別減少凋亡細(xì)胞比例5％～10％和15％～20％。進(jìn)一步對(duì)HL60細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)的survivin異構(gòu)體序列的測(cè)定顯示，HL60細(xì)胞表達(dá)野生型stlrvivin，而中性粒細(xì)胞

10、表達(dá)具有促凋亡潛能的survivin-2α異構(gòu)體。 結(jié)論： 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SUrVivin的表達(dá)隨著HL60細(xì)胞的分化而減少。在ATRA誘導(dǎo)分化的中性粒細(xì)胞樣HL60細(xì)胞中，survivin的表達(dá)能夠被GM-CSF誘導(dǎo)增加。然而GM-CSF對(duì)單核細(xì)胞樣分化的HL60細(xì)胞無誘導(dǎo)作用。GM-CSF/G-CSF不能誘導(dǎo)正常終末分化的中性粒細(xì)胞表達(dá)survivin。HL60細(xì)胞與中性粒細(xì)胞所表達(dá)的survivin剪接異構(gòu)體