接受GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激的中性粒細(xì)胞程序化細(xì)胞死亡和線粒體及相關(guān)基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）在機(jī)體固有性免疫應(yīng)答中具有重要作用，它是一把雙刃劍，其胞漿內(nèi)富含的細(xì)胞毒性物質(zhì)既可殺傷外來入侵的病原微生物，也可造成自身組織細(xì)胞的損傷。中性粒細(xì)胞通過程序化細(xì)胞死亡被吞噬細(xì)胞吞噬清除，從而避免炎癥反應(yīng)擴(kuò)大化，減少自身組織細(xì)胞損傷。Stephan等在研究GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激人中性粒細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)Siglec-9介導(dǎo)了caspase-

2、3、caspase-8依賴性和caspase-3、caspase-8非依賴性的PMN死亡，兩者都有活性氧簇（ROS）的參與，并且caspase-3、caspase-8非依賴性的PMN死亡具有非凋亡程序化細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特征[1]。本課題對(duì)GM-CSF+Anti-Siglec-9（抗表面分子唾液酸性粘合免疫球蛋白樣凝集素-9（anti-surface molecule sialic acid-binding immunoglobulin-

3、like lectin-9，Anti-Siglec-9）刺激人中性粒細(xì)胞程序化細(xì)胞死亡進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，探討NDP（NADH-ubiquinone oxidoreductase Fe-S protein，complexⅠ）、 SDH（succinate dehydrogenase flavoprotein subunit，complexⅡ）、Cyt P450（Cytochrome P450，complexⅢ）、C

4、OXs（cytochrome c oxidase subunit，complexⅣ）、Smac（線粒體蛋白）、 AIF（Apoptosis induced factor）、 Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、caspase-9、IAP（inhibitor of apoptosis protein）和線粒體在這種死亡形式中發(fā)揮的作用，為揭示這種中性粒細(xì)胞死亡過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑并

5、發(fā)展有效的免疫學(xué)措施以調(diào)控炎癥奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 方法：分離、純化正常人外周血中性粒細(xì)胞，在分別加入GM-CSF、Antimycin A（抗霉素A）、Anti-Siglec-9、GM-CSF+Anti-Siglec-9和不加任何刺激物情況下進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建致炎細(xì)胞因子（proinflammatory cytokine）、呼吸鏈阻斷、表面分子唾液酸性粘合免疫球蛋白樣凝集素-9結(jié)扎（Siglec-9ligation）、程序化細(xì)胞死亡

6、和自發(fā)性凋亡的細(xì)胞模型。運(yùn)用光鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的細(xì)胞模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究；低分子量瓊脂糖電泳顯示DNA片斷化；提取程序化細(xì)胞死亡組和自發(fā)性凋亡組中性粒細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE觀察各組蛋白表達(dá)情況；用抗AIF單克隆抗體通過western blotting技術(shù)檢測(cè)并比較AIF在不同死亡模型中的表達(dá)狀態(tài)；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9、

7、IAP的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：1.激光共聚焦掃描顯微鏡的結(jié)果顯示，GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激組的中性粒細(xì)胞線粒體形態(tài)與功能發(fā)生了變化，且與自發(fā)性凋亡組在細(xì)胞核染色和線粒體的結(jié)構(gòu)上都有十分明顯的差異。2.GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激中性粒細(xì)胞9小時(shí)后，激光共聚焦掃描顯微鏡顯示：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，絕大多數(shù)中性粒細(xì)胞的多葉核融合成單葉核，胞漿內(nèi)諸多空泡樣結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞膜保持完整性及無凋亡小體，不

8、同于壞死和自發(fā)性凋亡。3.低分子量DNA瓊脂糖電泳顯示，自發(fā)性凋亡組生成200 bp整數(shù)倍的DNA梯形條帶（DNA ladder），GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激的程序化細(xì)胞死亡組出現(xiàn)短而彌散的DNA電泳譜帶，主要分布在分子量較大的區(qū)段。4.不同時(shí)間段提取中性粒細(xì)胞蛋白，用抗AIF單克隆抗體對(duì)不同死亡模型進(jìn)行western blotting分析。 結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，GM-CSF+Anti-Siglec-9

9、可以刺激中性粒細(xì)胞AIF具有促中性粒細(xì)胞死亡的作用，其表達(dá)上調(diào)將引起中性粒細(xì)胞死亡加速。5. RT-PCR分析NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9和IAP的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GM-CSF組IAP基因的表達(dá)上調(diào)和SDH基因的表達(dá)下調(diào)（P<0.01），Antimycin A組NDP、SDH、Smac和caspase-9四個(gè)基因的表達(dá)均上調(diào)（P<0.01）。Anti-Si

10、glec-9組Smac和caspase-9兩個(gè)基因的表達(dá)均上調(diào)（P<0.01），GM-CSF+Anti-Siglec-9組與自發(fā)性凋亡組比較Cyt P450、COXs、Smac、AIF、caspase-9五個(gè)基因表達(dá)均明顯上調(diào)（P<0.01）。6.激光共聚焦顯示的AIF表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與自發(fā)性凋亡組比較，GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激組的中性粒細(xì)胞上調(diào)AIF的表達(dá)水平（P<0.01）。 結(jié)論：1.GM-CSF+Ant

11、i-Siglec-9可以誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞產(chǎn)生程序化細(xì)胞死亡，而且其死亡信號(hào)的傳導(dǎo)不同于傳統(tǒng)的凋亡。2.線粒體膜通透性增加導(dǎo)致跨膜電位降低可能是GM-CSF+Anti-Siglec-9誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞不同于傳統(tǒng)凋亡的程序化細(xì)胞死亡的重要分子基礎(chǔ)。3.Cyt P450、 COXs、 Smac、 AIF、 caspase-9參與GM-CSF+Anti-Siglec-9誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞不同于傳統(tǒng)凋亡的程序化細(xì)胞死亡的線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑。4.NDP