腫瘤激活的中性粒細胞通過GM-CSF-PD-L1通路抑制抗胃癌免疫并促進胃癌進展.pdf

1、胃癌是發(fā)展中國家癌癥相關(guān)死亡的首要原因之一。胃癌患者的預后很差，五年生存率低于30％。胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與胃癌的免疫抑制性微環(huán)境密切相關(guān)。
　　腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞及各種基質(zhì)細胞共同組成，其中包括大量免疫細胞，這些免疫細胞構(gòu)成了腫瘤的免疫微環(huán)境。中性粒細胞在實體瘤中大量浸潤，在不同腫瘤微環(huán)境中，其表現(xiàn)為不同的表型，發(fā)揮不同的功能。但是，目前還不清楚胃癌微環(huán)境中的中性粒細胞的表型、功能及其臨床意義。
　　目的：
　　1.

2、明確中性粒細胞在胃癌中的分布和表型特征;
　　2.探討胃癌微環(huán)境對中性粒細胞的調(diào)控及其機制;
　　3.明確中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制;
　　4.從體內(nèi)對中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制進行驗證，闡明胃癌激活中性粒細胞的臨床意義。
　　方法：
　　1.中性粒細胞在胃癌中的分布和表型特征
　　2.胃癌微環(huán)境對中性粒細胞的調(diào)控及其調(diào)控機制
　　3.中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制
　

3、　4.中性粒細胞的免疫抑制作用驗證及臨床意義研究
　　結(jié)果：
　　1.中性粒細胞在胃癌中的分布和表型特征;
　　1.1 胃癌患者外周血中性粒細胞百分率顯著高于健康成人。就胃癌患者本身，胃癌組織中性粒細胞百分率和絕對數(shù)（以每1，000，000個總細胞中中性粒細胞的絕對數(shù)量來統(tǒng)計）均顯著高于其他組織。免疫組織化學染色結(jié)果也表明，中性粒細胞在胃癌組織中浸潤增加。
　　1.2 與癌旁組織或非腫瘤正常胃組織相比，胃癌組織浸

4、潤的中性粒細胞高表達中性粒細胞激活相關(guān)分子CD54及免疫抑制性分子PD-L1。胃癌組織中浸潤的CD54+中性粒細胞百分率與PD-L1+中性粒細胞百分率呈顯著正相關(guān);胃癌組織中浸潤的CD54+中性粒細胞的絕對數(shù)與PD-L1+中性粒細胞絕對數(shù)呈顯著正相關(guān)。流式染色結(jié)果表明胃癌組織內(nèi)浸潤的中性粒細胞共表達CD54和PD-L1分子，提示胃癌組織內(nèi)浸潤的中性粒細胞的表型為激活/抑制雙重表型。
　　2.胃癌微環(huán)境對中性粒細胞的調(diào)控及其調(diào)控機制

5、
　　2.1 與NTCS及1640培養(yǎng)基(Medium)相比，TTCS可以顯著抑制中性粒細胞的凋亡，說明胃癌微環(huán)境可能通過延長中性粒細胞壽命而使中性粒細胞浸潤增加。
　　2.2 與NTCS及Medium相比，TTCS可以顯著上調(diào)中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達，說明胃癌微環(huán)境對于激活中性粒細胞并維持其免疫抑制表型起著重要作用。
　　2.3 腫瘤組織標本基因芯片分析結(jié)果顯示:TGF-β，M-CSF，G-CSF，I

6、L-1β，IL-17A，IL-6，IL-23，IL-10，GM-CSF，IFN-γ，IL-22等細胞因子在腫瘤組織中高表達。用這些重組細胞因子刺激外周血中性粒細胞，發(fā)現(xiàn):GM-CSF可以顯著上調(diào)中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達。此外，阻斷TTCS中的GM-CSF可以顯著抑制中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達，而在NTCS中加入重組人GM-CSF后，可以顯著上調(diào)中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達。用ELISA試劑盒檢測

7、胃癌組織、非腫瘤正常胃組織、TTCS及NTCS中的GM-CSF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的GM-CSF表達顯著高于非腫瘤正常胃組織，TTCS中的GM-CSF濃度顯著高于NTCS。同時胃癌組織中的GM-CSF濃度與CD54+中性粒細胞及PD-L1+中性粒細胞浸潤數(shù)量呈正相關(guān)。免疫熒光雙染結(jié)果顯示GM-CSF來源于胃癌細胞。以上結(jié)果表明胃癌上皮細胞來源的GM-CSF在激活中性粒細胞并維持其免疫抑制表型中起著關(guān)鍵作用。
　　2.4 阻斷JAK

8、或STAT3信號通路后，TTCS或GM-CSF均不能上調(diào)中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達;WB結(jié)果顯示:TTCS可以誘導中性粒細胞中STAT3信號通路的磷酸化，而阻斷TTCS中的GM-CSF后，STAT3的磷酸化受到抑制。說明GM-CSF上調(diào)中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達依賴于JAK-STAT3信號通路。
　　3.中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制
　　3.1 與非腫瘤正常胃組織浸潤的中性粒細胞相比，胃癌組

9、織浸潤的中性粒細胞可以顯著抑制CD3+T細胞的增殖及INFγ的產(chǎn)生，該抑制作用依賴于PD-L1通路。對胃癌標本的流式分析結(jié)果顯示胃癌微環(huán)境中浸潤的中性粒細胞百分率和T細胞百分率呈負相關(guān)，胃癌微環(huán)境中浸潤的中性粒細胞絕對數(shù)和T細胞絕對數(shù)也呈負相關(guān)。
　　3.2 條件性中性粒細胞可以顯著抑制同種或異種CD3+T細胞的增殖及INFγ的產(chǎn)生，該抑制作用依賴于PD-L1通路。
　　3.3 條件性中性粒細胞可以顯著抑制同種或異種PD-1

10、+CD3+T細胞的增殖及INFγ的產(chǎn)生，該抑制作用依賴于PD-L1通路;而對PD-1-CD3+T細胞沒有抑制作用。說明條件性中性粒細胞對T細胞的抑制作用是依賴PD-1-PD-L1通路的。胃癌標本流式統(tǒng)計結(jié)果顯示胃癌微環(huán)境中的PD-L1+中性粒細胞與PD-1+T細胞在百分率和絕對數(shù)上呈負相關(guān)。
　　4.中性粒細胞的免疫抑制作用驗證及臨床意義研究
　　4.1 與Medium組小鼠(注射PBS)相比，T cells+N組小鼠(注射

11、經(jīng)正常中性粒細胞(N)處理的T細胞）的移植瘤體積明顯減小，說明正常的T細胞應答可以顯著抑制移植瘤生長;而與T cells+N組小鼠相比，T cells+TCN組小鼠(注射經(jīng)條件性中性粒細胞(TCN)處理的T細胞）的移植瘤體積明顯增加，說明TCN抑制了T細胞反應，從而解除了T細胞應答對腫瘤生長的抑制作用;與T cells+TCN組小鼠或T cells+TCN+control IgG組（共培養(yǎng)體系中加入control IgG抗體）相比，T

12、cells+TCN+anti-PD-L1組小鼠（共培養(yǎng)體系中加入anti-PD-L1抗體）的移植瘤體積明顯縮小(P＜0.05)，說明TCN對T細胞應答的抑制作用是通過免疫抑制性分子PD-L1起作用的。
　　4.2 檢測小鼠脾臟中IFN-γ+T細胞的應答情況，發(fā)現(xiàn):與T cells+TCN組或T cells+TCN+ control IgG處理組相比，T cells+TCN+anti-PD-L1組小鼠脾臟內(nèi)IFN-γ+T細胞的比例顯

13、著增加，說明TCN對T細胞應答的抑制作用是通過PD-L1實現(xiàn)的。
　　4.3 免疫組化染色結(jié)果顯示:與T cells+TCN組或T cells+TCN+ control IgG處理組相比，T cells+TCN+anti-PD-L1組小鼠移植瘤細胞的增殖明顯受到抑制，移植瘤內(nèi)浸潤的CD3+T細胞明顯增加。說明TCN通過PD-L1抑制CD3+T細胞增殖，從而使移植瘤內(nèi)CD3+T細胞浸潤減少，促進移植瘤進展。
　　4.4 臨床相

14、關(guān)性分析顯示，增高的中性粒細胞百分率與淋巴管侵襲的累及、腫瘤大小的增長和腫瘤侵襲(T)分期的進展相關(guān)。根據(jù)胃癌組織浸潤中性粒細胞的百分率中位數(shù)(5.24％)將病人分為中性粒細胞高浸潤組（≥5.24％）和中性粒細胞低浸潤組(＜5.24％)，統(tǒng)計病人44個月的總體生存率發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞高浸潤組病人的總體生存率顯著低于浸潤低組。用胃癌組織浸潤中性粒細胞絕對數(shù)對病人分組也得到同樣的結(jié)論。此外，根據(jù)胃癌組織浸潤PD-L1+中性粒細胞的百分率中位數(shù)

15、(24％)將病人分為PD-L1+中性粒細胞高浸潤組（≥24％）和PD-L1+中性粒細胞低浸潤組(＜24％)，統(tǒng)計病人20個月的總體生存率發(fā)現(xiàn)，PD-L1+中性粒細胞高浸潤組病人的總體生存率顯著低于浸潤低組。用胃癌組織浸潤PD-L1+中性粒細胞絕對數(shù)對病人分組也得到同樣的結(jié)論。
　　結(jié)論：
　　1.胃癌微環(huán)境中有大量中性粒細胞浸潤，其表現(xiàn)為激活/抑制雙重表型。
　　2.胃癌微環(huán)境能夠延長中性粒細胞的壽命;胃癌細胞來源的G

16、M-CSF通過JAK-STAT3信號通路激活中性粒細胞并上調(diào)其表面PD-L1的表達。
　　3.胃癌激活的中性粒細胞通過PD-L1-PD-1通路抑制T細胞的功能，從而抑制胃癌免疫并促進胃癌進展。
　　4.中性粒細胞百分比和數(shù)量與胃癌進展密切相關(guān)，并且可以預測病人的總體生存率。
　　5.PD-L1+中性粒細胞的百分比和數(shù)量與胃癌進展密切相關(guān)，并且可以預測病人的總體生存率。
　　意義
　　本文在胃癌中發(fā)現(xiàn)了一群具