腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的化療耐藥機(jī)制及其多相位阻遏.pdf

1、研究背景和目的：化學(xué)藥物治療是當(dāng)今腫瘤關(guān)鍵治療手段之一。腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥問(wèn)題是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的常見(jiàn)因素和關(guān)鍵性難題。大多數(shù)腫瘤患者的死因直接或間接與耐藥相關(guān)。以實(shí)體瘤為主攻對(duì)象研究實(shí)體瘤化療耐藥的分子機(jī)制將是非常有意味和挑戰(zhàn)性的工作，當(dāng)今抗腫瘤藥物的研究與開(kāi)發(fā)已進(jìn)入一個(gè)嶄新的時(shí)代，抗腫瘤藥物正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物，向針對(duì)機(jī)制的多環(huán)節(jié)作用的新型抗腫瘤藥物發(fā)展。這其中包括以細(xì)胞信號(hào)分子為靶點(diǎn)的基礎(chǔ)研究。目前，大量研究認(rèn)為腫瘤微環(huán)境

2、在誘導(dǎo)腫瘤獲得性耐藥和抵抗細(xì)胞凋亡的生理性調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。腫瘤微環(huán)境的特殊生態(tài)位可能為腫瘤細(xì)胞亞群在暴露于化療藥物之后提供了一個(gè)“避難所”，即一種生存優(yōu)勢(shì)。實(shí)體腫瘤的微環(huán)境包括細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，激素，低PH，低氧和各種細(xì)胞外基質(zhì)等。其中纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是很重要的細(xì)胞外基質(zhì)，與腫瘤細(xì)胞粘附分子受體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、移動(dòng)等過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)作用。本項(xiàng)目選擇模擬體內(nèi)環(huán)境的三維的細(xì)胞群集體的粘附耐藥模

3、型，從實(shí)體瘤微環(huán)境的角度來(lái)研究腫瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制，以Akt2介導(dǎo)的凋亡耐藥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)，探討細(xì)胞凋亡與腫瘤耐藥關(guān)系。 方法： 1、建立粘附耐藥模型(1)體外三維培養(yǎng)建立粘附耐藥模型和低氧誘導(dǎo)建立低氧耐藥模型：受試細(xì)胞分別為卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDAMB231細(xì)胞等細(xì)胞(2)運(yùn)用紫杉醇、順鉑等臨床一線，二線化療藥物分別處理模型細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率；Hoech

4、st-33258染色，AnnexinV-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；以檢測(cè)耐藥模型的藥物敏感性。 2、驗(yàn)證AKT2在粘附耐藥中的作用(1)Western-blot、免疫沉淀法檢測(cè)在粘附耐藥模型中AKT2的表達(dá)和活性。(2)用AKT2的上游分子PI3K的抑制劑ly294002處理各組細(xì)胞，觀察其藥物敏感性，初步驗(yàn)證AKT2在粘附耐藥中的作用。(3)構(gòu)建AKT2全長(zhǎng)正義cDNA真核表達(dá)載體。(4)構(gòu)建AKT2shRNA真核表達(dá)載體。(5

5、)分別將上述載體和各自對(duì)照載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，穩(wěn)定篩選。然后建立耐藥細(xì)胞模型，化療藥物處理這些細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)基因沉默效率，光鏡、電鏡、confocal和熒光顯微鏡對(duì)比細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以進(jìn)一步驗(yàn)證AKT2在耐藥中的作用。 3、短發(fā)卡狀RNA誘導(dǎo)Akt2基因沉默在粘附耐藥中的應(yīng)用研究(1)高效shRNA載體的改建：針對(duì)本室保存的shRNA真核表達(dá)載體pEGFP-C1-U6中U6啟動(dòng)子

6、序列，構(gòu)建可以同時(shí)插入3個(gè)目的片段的shRNA表達(dá)載體，(2)設(shè)計(jì)三對(duì)針對(duì)Akt2基因的反向重復(fù)序列，選擇19nt的目的序列——LOOP堿基——反向重復(fù)序列及其互補(bǔ)鏈。(3)建立針對(duì)Akt2基因的三種基因沉默方法：?jiǎn)挝稽c(diǎn)基因沉默法；雙位點(diǎn)基因沉默法；三位點(diǎn)基因沉默法。(4)FACS檢測(cè)紫杉醇的敏感性 4、研究耐藥模型中，AKT2介導(dǎo)的存活通路對(duì)survivin蛋白的調(diào)節(jié)作用(1)構(gòu)建survivin全長(zhǎng)正義cDNA真核表達(dá)載體，

7、轉(zhuǎn)染細(xì)胞。(2)Western-blot檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)、流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。驗(yàn)證survivin的凋亡抑制作用，化療藥物對(duì)survivin蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。(3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AKT2全長(zhǎng)正義cDNA真核表達(dá)載體，AKT2shRNA真核表達(dá)載體?；熕幬锾幚砑?xì)胞，Western-blot檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)。觀察化療藥物對(duì)survivin蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 5、研究耐藥模型中，AKT2

8、介導(dǎo)的存活通路對(duì)P38凋亡通路的抑制作用，以探討AKT2介導(dǎo)實(shí)體瘤耐藥的分子機(jī)制。(1)構(gòu)建P38全長(zhǎng)正義cDNA真核表達(dá)載體。(2)用化療藥物處理對(duì)照細(xì)胞和模型細(xì)胞，提取蛋白，westernblot分析AKT2、ASK1、JNK、P38總蛋白、磷酸化蛋白的表達(dá)。(2)分別轉(zhuǎn)染AKT2正義全長(zhǎng)載體和shRNA載體，穩(wěn)定篩選。用篩選后的細(xì)胞建立模型，化療藥物處理細(xì)胞，提取蛋白，western-blot分析AKT2、ASK1、JNK、P38

9、總蛋白、磷酸化蛋白的表達(dá)。(3)藥物處理模型細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，提取蛋白。用AKT2的抗體沉淀蛋白，然后進(jìn)行Westernblot分析，檢測(cè)ASK1P38蛋白的表達(dá)，以明確他們和AKT2之間是否存在相互作用。 結(jié)果： 1、兩株人卵巢癌細(xì)胞株和兩株人乳腺癌細(xì)胞株接種在FN-coated孔板上，可以抵抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，是最佳的耐藥模型。本實(shí)驗(yàn)成功建立了模擬體內(nèi)環(huán)境的三維的細(xì)胞群集體的粘附耐藥模型。 2、活化(磷酸化)

10、的Akt2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥；細(xì)胞與FN的粘附可以上調(diào)Akt2并導(dǎo)致Akt2的活化；細(xì)胞與FN的粘附可以上調(diào)Akt2并導(dǎo)致Akt2的活化。 3、高效shRNA載體構(gòu)建成功(shRNA-p3)；將針對(duì)同一基因的三對(duì)片斷同時(shí)插入一個(gè)載體，穩(wěn)定篩選后可以達(dá)到很高的沉默效率。在粘附耐藥中，Akt2起了關(guān)鍵性的作用。阻斷Akt2的表達(dá)；抑制了Akt2的活性，可以逆轉(zhuǎn)化療耐藥。 4、Surivin高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性

11、降低；多西紫杉醇可以通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Surivin的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞-FN粘附介導(dǎo)的PI3K/Akt2信號(hào)途徑的激活可以阻斷多西紫杉醇對(duì)Surivin表達(dá)的下調(diào)。 5、活化的Akt2可以抑制化療藥物對(duì)P38死亡通路的激活；FN/Akt2信號(hào)通路對(duì)p38信號(hào)通路有抑制作用。且Akt2蛋白對(duì)P38蛋白的抑制作用是間接的，其中間分子是ASK1。 結(jié)論： 1、細(xì)胞-FN粘附可以模擬腫瘤微環(huán)境，建立粘附耐藥模型。