PRDM1突變體對細胞周期調(diào)控的影響及其臨床意義的初步研究.pdf

1、目的:PRDM1基因是PRDM基因家族的重要成員,其編碼的PRDM1蛋白是B細胞向漿細胞終末分化的關(guān)鍵調(diào)控因子,它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未有定論。近年來有研究發(fā)現(xiàn)在彌漫性大B細胞淋巴瘤中,PRDM1基因存在較高頻率的突變;我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤中,PRDM1基因的第366位核苷酸可發(fā)生純合型點突變(Mut366),提示該基因和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。多發(fā)性骨髓瘤中存在兩種野生型PRDM1蛋白亞型,PRDM1α和PRDM1β

2、,而上述Mut366突變發(fā)生在PRDM1α蛋白上。因此,本研究旨在比較PRDM1野生型和突變體蛋白對細胞周期調(diào)控的影響,初步探索當(dāng)PRDM1發(fā)生突變后對腫瘤細胞的生物學(xué)行為可能產(chǎn)生的影響,從而進一步探討PRDM1基因突變在多發(fā)性骨髓瘤疾病進展中的作用,為下一階段該疾病的預(yù)后分層和個體化靶向治療研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法:用分別插入野生型和突變型PRDM1基因片段的GFP共表達載體分別轉(zhuǎn)染增殖狀態(tài)良好的Hela細胞,同時

3、將不表達PRDM1基因的空載體在相同條件下轉(zhuǎn)染Hela細胞作為陰性對照,PI染色后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期時相的變化,并對結(jié)果進行分析,同時繪制轉(zhuǎn)染4天后的細胞生長曲線,比較它們生長速度的差異。進一步應(yīng)用Western blot的方法檢測過表達野生型和突變型PRDM1的Hela細胞中細胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達情況,比較其間的差異。最后模擬多發(fā)性骨髓瘤患者中PRDM1基因可能存在的不同表達狀況,分別共轉(zhuǎn)染野生型PRDM1α和突變型PRD

4、M1(Mut366),及野生型PRDM1β和突變型PRDM1(Mut366),檢測細胞周期和繪制細胞生長曲線,初步探索PRDM1的不同蛋白表達環(huán)境對腫瘤細胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染了空載體的細胞G1期的比例約49.33％,轉(zhuǎn)染了野生型PRDM1α的細胞G1期比例明顯增高至66.10％,而轉(zhuǎn)染突變體Mut366的細胞G1期比例又降至52.12％,而三者S期細胞的比例分別為:36.16％、12.79％、29.77％,三者的G2

5、期細胞比例無明顯差異。細胞轉(zhuǎn)染后4天內(nèi)的生長曲線顯示轉(zhuǎn)染空載體的細胞增殖未受影響,而轉(zhuǎn)染了野生型PRDM1α的細胞生長停滯,細胞的數(shù)量幾乎未發(fā)生變化,轉(zhuǎn)染了突變體Mut366的細胞雖按照一定的比例繼續(xù)增殖,但是比轉(zhuǎn)染空載體的細胞的生長速度要慢,這與細胞周期的結(jié)果是相吻合的。與轉(zhuǎn)染了空載體的對照細胞相比,過表達了PRDM1α之后,細胞周期調(diào)控蛋白p53、p21的表達明顯上調(diào),而過表達了PRDM1β之后,對p53和p21的上調(diào)作用明顯減弱,

6、而突變體Mut366過表達之后則幾乎喪失了對p53和p21的誘導(dǎo)上調(diào)的作用。共轉(zhuǎn)染了野生型PRDM1α和PRDM1β的細胞的G1期比例位于分別單轉(zhuǎn)PRDM1α和PRDM1β的細胞之間,而共表達了PRDM1β和突變體Mut366的細胞G1期比例明顯下降,繪制細胞生長曲線結(jié)果與之吻合。
　　 結(jié)論:進一步驗證了野生型PRDM1α有較強的抑制細胞增殖,將大部分細胞阻滯在G1期的功能。當(dāng)PRDM1α的第366位核苷酸發(fā)生純合突變后,原有