LI患者TGM 1基因序列分析及其指甲中TGase 1活性與內(nèi)皮蛋白表達相關(guān)性分析.pdf

1、背景：
　　 人體表面的上皮細胞(Surface epithelial cells)如角質(zhì)形成細胞(keratinocyte，KC)等，在經(jīng)歷了細胞分化演變后形成一個復(fù)層表皮結(jié)構(gòu)。該復(fù)層表皮結(jié)構(gòu)是機體抵御外界影響的十分堅固的物理、化學(xué)屏障。而實現(xiàn)該屏障功能最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)成分是位于表皮最淺層的角質(zhì)膜套（cornified cell envelope，CE）。角質(zhì)膜套是一個堅固的蛋白質(zhì)/類脂聚合體，形成于細胞膜下，而固定于已死亡的角質(zhì)

2、細胞(cornified cells)表面。它包含蛋白膜套（protein envelope）和脂質(zhì)膜套(lipidenvelope)兩個部分。在角質(zhì)形成細胞終末分化階段，內(nèi)皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、富含脯氨酸小蛋白(small proline-rich protein)等結(jié)構(gòu)蛋白的共價交聯(lián)，對于角質(zhì)膜套的形成具有十分重要的意義。這些交聯(lián)反應(yīng)需要轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1（transglutaminase1，TG

3、ase1）的參與。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1是一個鈣離子依賴性酶，可以催化蛋白分子間異肽鍵的形成。
　　 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1在角質(zhì)形成細胞的終末分化階段，開始表達并被激活，通過交聯(lián)反應(yīng)來促進角質(zhì)膜套的生成。編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1的基因(TGM1)已經(jīng)被學(xué)者從人類基因組DNA中分離出來，并進行了描述。其含有14.3千堿基對，包含了15個外顯子。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1是參與角質(zhì)膜套的合成而被人們所認識的。在角質(zhì)形成細胞分化進程中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1被蛋白水解酶有限

4、裂解而激活，進而參與到隨后的底物交聯(lián)中去。因此，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1活性的紊亂可以產(chǎn)生異常的皮膚表型。
　　 內(nèi)皮蛋白是第一個被發(fā)現(xiàn)和克隆的前體物質(zhì)，是角質(zhì)膜套的一個重要的組成成分。其開始表達于角質(zhì)形成細胞分化階段早期，被認為是早期膜套的組成成分，為隨后其它的前體物質(zhì)的交聯(lián)提供膜套支架。在體外，該交聯(lián)優(yōu)先選擇Gln496位點。交聯(lián)是一個有序的過程，Gln496是第一個交聯(lián)位點，其他的交聯(lián)位點隨時間的往后推移而逐漸發(fā)揮作用。
　　

5、 板層狀魚鱗?。↙amellarichthyosis，LI）是一種常染色體隱性遺傳病，是一種嚴(yán)重的皮膚角化紊亂，表現(xiàn)為皮膚的泛發(fā)性過度角化。由于在表皮終末分化階段，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1介導(dǎo)了細胞膜套交聯(lián)的形成，所以TGM1突變造成的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1的功能缺陷被普遍認為是板層狀魚鱗病的病因。此外，在板層狀魚鱗病患者的異常角質(zhì)膜套中，人們觀察到了過度表達的內(nèi)皮蛋白。因此，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1的功能異?？梢愿淖儍?nèi)皮蛋白的交聯(lián)和角質(zhì)膜套的形成。但是，轉(zhuǎn)谷氨

6、酰胺酶1的活性和內(nèi)皮蛋白的表達兩者之間的聯(lián)系仍然不清楚，亦未見有相關(guān)報道。
　　 本實驗對板層狀魚鱗病患者TGM1基因的突變，板層狀魚鱗病患者和對照組的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1的活性、內(nèi)皮蛋白的表達以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1的活性和內(nèi)皮蛋白的表達兩者之間的相關(guān)性進行了探討。材料和方法：
　　 1.收集8例板層狀魚鱗病患者(LI組)和8例志愿者（對照C組）指甲，并抽取2例板層狀魚鱗病血液標(biāo)本。
　　 2.將抽取的2例板層狀魚鱗病血液

7、標(biāo)本送本元正陽基因公司進行TGM1基因序列分析。
　　 3.采用CellyticTM試劑提取指甲總蛋白。
　　 4.樣品蛋白進行SDS-PAGE電泳，對電泳條帶進行轉(zhuǎn)膜，再采用免疫印跡法檢測內(nèi)皮蛋白。（圖像分析）。
　　 5.采用斑點印跡法檢測TGase1酶活性。（圖像分析）。
　　 6.采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進行兩組間的方差分析和相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.患者TGM

8、1基因序列分析：2例LI患者TGM1基因序列的第3、8、12及13外顯子皆有錯義的點突變，其中1例癥狀較重者還有第3外顯子150T的缺失導(dǎo)致的提前終止。
　　 2.兩組指甲總蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果比較：LI組指甲總蛋白SDS-PAGE電泳顯示5條主帶，即69kDa、63kDa、54kDa、48kDa、38kDa，C組顯示后4條主帶。LI組69kDa、63kDa的灰度均值(GSM)分別為131.98±1.35、154.36±

9、1.46，C組63kDa的GSM為136.56±1.38，兩組63kDa的GSM相比，P＜0.05。
　　 3.兩組指甲內(nèi)皮蛋白表達的GSM比較：LI組內(nèi)皮蛋白表達于69kDa、63kDa主帶，其GSM分別為139.92士1.44、148.54士1.6;C組內(nèi)皮蛋白表達于63kDa主帶，其GSM為135.96±1.10。兩組63kDa內(nèi)皮蛋白表達的GSM相比，P＜0.05。
　　 4.兩組指甲TGase1酶活性的GSM比

10、較：TGase1的GSM為122.49±1.32，C組為169.11±1.14，C組TGase1斑點印跡信號強于LI組，兩組相比，P＜0.05。
　　 5.內(nèi)皮蛋白表達與TGase1酶活性的相關(guān)性：C組63kDa內(nèi)皮蛋白表達與TGase1酶的GSM呈正相關(guān)（r=0.762，P＜0.05），LI組63kDa、69kDa內(nèi)皮蛋白與TGase1酶的GSM呈負相關(guān)（r分別為-0.780、-0.837，P均＜0.05）。
　　 結(jié)

11、論：
　　 1.兩例板層狀魚鱗病患者的TGM1基因序列分析，顯示第8、12、及13外顯子皆有錯義的點突變，其中1例癥狀較重患者還有第3外顯子150T的缺失導(dǎo)致的提前終止，提示LI組的TGase1的表達存在異常。
　　 2.LI組指甲總蛋白SDS-PAGE電泳顯示5條主帶，而C組顯示4條主帶，提示LI組的指甲總蛋白存在異常。
　　 3.LI組內(nèi)皮蛋白表達于69kDa、63kDa主帶，C組內(nèi)皮蛋白定位于63kDa主帶