氧化型低密度脂蛋白及阿托伐他汀對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景: 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(reninangiotensinsystem，RAS)在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)形成中起著重要作用，血管緊張素II(angiotensinII，AngII)是系統(tǒng)中的關(guān)鍵效應(yīng)肽，通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡、促進(jìn)氧化型低密度脂蛋白攝取、產(chǎn)生氧自由基和影響纖溶功能等多方面參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程，阻斷AngII的生物學(xué)效應(yīng)可通過抗高血壓、抗炎、抗增殖和氧化應(yīng)激等產(chǎn)生強(qiáng)大

2、的抗As作用。研究發(fā)現(xiàn)，AngII與氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，ox-LDL)在As發(fā)生過程中有著協(xié)同作用，AngII通過促進(jìn)低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)氧化修飾及修飾后LDL攝取，參與As的發(fā)生，而ox-LDL可調(diào)節(jié)RAS活性成分表達(dá)，增加AngII的生物學(xué)效應(yīng)。 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-convertingenzym

3、e2，ACE2)是2000年發(fā)現(xiàn)的RAS新成員，是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-convertingenzyme，ACE)的同系物，人類ACE的第一個(gè)同源基因，在心臟和腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，主要功能是轉(zhuǎn)化AngII直接產(chǎn)生血管緊張素(1-7)(angiotensin(1-7)，Ang(1-7))，還可裂解血管緊張素I(angiotensinI，AngI)生成血管緊張素(1-9)(angiotensin(1-9)，Ang(1

4、-9))，Ang(1-9)繼續(xù)被ACE水解為Ang(1-7)。在功能上，ACE2廣泛參與高血壓、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、慢性肝損傷、急性呼吸窘迫征、妊娠等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-convertingenzymeinhibitor，ACEI)能抑制As形成，但在人血管組織中，AngII的生成60％～80％來源于糜酶的作用，ACEI并不能完全阻止AngII生成，而ACE2作

5、為能轉(zhuǎn)化AngI和直接降解AngII的血管調(diào)節(jié)肽酶，能降低局部組織AngII，增加Ang(1-7)濃度，在動(dòng)脈斑塊內(nèi)的新生內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均已發(fā)現(xiàn)ACE2高度表達(dá)，分析其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。 他汀類藥物作為降脂藥物，其抗As機(jī)制仍是目前研究的熱點(diǎn)，近年來，阿托伐他汀的非調(diào)脂作用越來越引起關(guān)注。系列臨床研究及實(shí)驗(yàn)證據(jù)均發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能調(diào)節(jié)RAS，通過下調(diào)血管緊張素II1型受體(angiotensinIItype1

6、receptor，AT1R)mRNA表達(dá)及受體密度，削弱AngII的生物學(xué)效應(yīng)。阿托伐他汀作為最新一代羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy-methyl-glutarylcoenzymeA，HMG-CoA)還原酶抑制劑，除了具有調(diào)脂作用外，還具有抗炎、抗氧化、抗凝等非調(diào)脂作用，從而起到穩(wěn)定斑塊和抗As的目的。 Ox-LDL能與其特異受體-血凝素樣氧化型低密度脂蛋白內(nèi)皮受體(Lectin-likeOxidizedLowDensity

7、LipoproteinReceptor-1，LOX-1)結(jié)合進(jìn)入血管壁，上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞AT1R及內(nèi)皮細(xì)胞ACE表達(dá)等誘導(dǎo)As形成，但其能否通過影響ACE2的表達(dá)來調(diào)節(jié)RAS活性成分以及阿托伐他汀對(duì)該過程有何影響，目前還不十分清楚。針對(duì)以上問題，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)及蛋白質(zhì)Western印跡法(westernblot)，在細(xì)

8、胞生物學(xué)水平觀察ox-LDL及阿托伐他汀對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanvascularendothelialcells，HUVECs)ACE2基因和蛋白表達(dá)的影響，為臨床防治As提供理論基礎(chǔ)。 目的: 1、觀察ox-LDL在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平對(duì)HUVECs表達(dá)ACE2的影響。 2、觀察阿托伐他汀對(duì)ACE2表達(dá)的影響及對(duì)ox-LDL的干預(yù)作用。 3、探討ox-LDL、阿托伐他汀及內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)三者間

9、是否存在某種聯(lián)系及在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用機(jī)制。 對(duì)象和方法: 1.對(duì)象: 體外條件培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。設(shè)計(jì)：觀察對(duì)比實(shí)驗(yàn)。 2方.法: 2.1ox-LDL制備：采用超高速密度梯度離心法從健康人新鮮血液分離出LDL，并將蛋白終濃度調(diào)整為500ug/mL，加入終濃度為10mmol/mL的CuSO4溶液中氧化，在濃度為100μmol/L的EDTA溶液中終止氧化。Ox-LDL純度鑒定：用瓊脂糖凝膠

10、電泳法鑒定ox-LDL純度，電泳條帶為單一條帶。Bradford法測定蛋白含量。 2.2阿托伐他汀溶液配制：阿托伐他汀原料藥60.47mg，溶于1ml無水乙醇，加入0.1mol/LNaOH1.5ml，50℃水浴鍋中靜置2h，以0.1mmol/LHC1調(diào)pH至7.2，加PBS至總體積5ml，過濾后分裝，-70℃凍存，貯存濃度為10mmol/L。 2.3HUVECs細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代：凍存細(xì)胞株復(fù)蘇后接種于M199完全培養(yǎng)基(

11、pH7.4，含10％FBS、50ng/L的ECGS、5kU/L肝素、100kU/L青霉素和100mg/L鏈霉素)，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，2-3d后鋪滿培養(yǎng)瓶。0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，取3-6代增殖細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。按2.0×106個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，加含10％FBS的M199培養(yǎng)基置于37℃、5％CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待HUVECs生長呈亞融合狀態(tài)時(shí)，換以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，分別加

12、入不同濃度ox-LDL及阿托伐他汀刺激。 2.4實(shí)驗(yàn)分組及條件培養(yǎng)(各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，n=6). 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組均數(shù)間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.HUVECs鑒定及細(xì)胞活力測定： 在倒置顯微鏡下，HUVECs呈單層生長

13、，呈梭形魚貫狀排列或呈多角形鑲嵌排列。VⅢ因子單抗間接免疫熒光染色結(jié)果顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)較高密度的Ⅷ因子相關(guān)抗原，陽性率為100％，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞記數(shù)結(jié)果顯示各組HUVECs存活率在96％以上。 2.Ox-LDL對(duì)ACE2基因及蛋白表達(dá)的影響： 基礎(chǔ)狀態(tài)下，培養(yǎng)的HUVECs即有ACE2mRNA及蛋白表達(dá)。不同濃度ox-LDL均顯著下調(diào)ACE2基因和蛋白表達(dá)(F=57.438，P<0.00

14、1和F=42.299，P<0.001)。與空白對(duì)照組比較，各濃度ox-LDL刺激組ACE2mRNA表達(dá)量分別降低為空白對(duì)照組的73％、51％和33％(均P<0.001)，蛋白表達(dá)量降低為空白對(duì)照組的81％、50％及32％(P=0.010，P<0.001，P<0.001)，不同濃度組間ACE2mRNA比較差異亦有顯著性(P=0.000，P=0.004，P=0.001)，蛋白表達(dá)同樣存在顯著性差異(P=0.000，P=0.014，P=0.0

15、00)。 40mg/Lox-LDL在不同時(shí)間均顯著下調(diào)ACE2基因和蛋白表達(dá)(F=36.483，P<0.001和F=24.985，P<0.001)。于6、12和24h，ACE2mRNA表達(dá)量分別降低為空白對(duì)照組的66％、56％和50％(均P<0.001)，蛋白表達(dá)降低為空白對(duì)照組的63％、53％及49％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。 3.阿托伐他汀對(duì)ACE2基因及蛋白表達(dá)的影響： 在不同濃度阿托伐他汀刺

16、激組，ACE2mRNA及蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.566，P=0.299和F=0.867，P=0.474)，不同時(shí)間各組差異同樣不存在顯著性(F=1.102，P=0.257和F=0.371，P=0.858))。 4.阿托伐他汀對(duì)ox-LDL下調(diào)ACE2基因及蛋白表達(dá)的干預(yù)作用： 阿托伐他汀能抑制ox-LDL對(duì)ACE2基因和蛋白表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)(F=28.199，P<0.001和F=20.321，P<0.001)。1

17、umol/L阿托伐他汀干預(yù)組與單純40mg/Lox-LDL對(duì)照組比較，ACE2mRNA及蛋白表達(dá)沒有顯著性差異(P=0.071和P=0.188)。10umol/L阿托伐他汀干預(yù)組與對(duì)照組比較，ACE2mRNA及蛋白表達(dá)分別增加了1.75、1.69倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。高濃度(10umol/L)與低濃度(1umol/L)阿托伐他汀干預(yù)組比較，基因及蛋白表達(dá)同樣均存在顯著性差異(P<0.001)。 結(jié)論: