NZB、NZW、C57BL-6小鼠Tim-1cDNA序列分析及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建.pdf

1、前言
　　2001年，McIntire等通過(guò)基因定位克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)鼠的新的基因家族，命名為T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomainprotein，Tim)家族。Tim-1是Tim家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員。在激活的Th2細(xì)胞表面呈高水平表達(dá)，此外在樹突狀細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腎管狀上皮細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞表面也有少量或低水平表達(dá)。
　　T

2、im-1作為一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用:(1)Tim-1作為協(xié)同刺激受體促進(jìn)Th2細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)Th2應(yīng)答;(2)Tim-1粘蛋白區(qū)在維持調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分泌IL-10水平和自身免疫耐受中發(fā)揮了一定作用，缺乏粘蛋白區(qū)的小鼠更易獲自身免疫病;(3)Tim-1表達(dá)于樹突細(xì)胞，被Tim-1信號(hào)激活的樹突細(xì)胞可以促進(jìn)T細(xì)胞的應(yīng)答;(4)Tim-1在健康成熟的腎臟不表達(dá)或表達(dá)很低，而在急性缺血性或中

3、毒性腎臟損傷時(shí)，近曲小管上皮細(xì)胞Tim-1的表達(dá)明顯上調(diào)，此種上調(diào)反映了近端腎小管上皮細(xì)胞的分化、間質(zhì)纖維化和炎癥浸潤(rùn)。同時(shí)，Tim-1基因多態(tài)性與氣道高反應(yīng)性(AHR)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘(Asthma)、多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等多種自身免疫病有著密不可分的關(guān)系。
　　我們此前對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠NZBxNZWF1小鼠狼瘡腎炎遺傳因素的研究發(fā)現(xiàn)，其親代新西蘭白鼠(NZW)和新西蘭黑鼠(NZB)

4、Tim-1的cDNA序列有所不同。NZB小鼠Tim-1cDNA較NZW小鼠Tim-1cDNA胞漿區(qū)序列缺失了793-925共132個(gè)堿基。為了了解NZB小鼠Tim-1cDNA序列的此種改變是否與NZB小鼠不易患狼瘡腎炎有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建攜帶有NZB、NZW和C57BL/6小鼠Tim-1編碼序列的真核表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)研究NZB小鼠Tim-1的功能奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　一、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1cDN

5、A序列的生物信息學(xué)分析
　　用VectorNTI軟件的Align功能對(duì)NZB、NZW、C57BL/6(參考序列NM_134248.2)小鼠Tim-1的cDNA序列進(jìn)行比對(duì);用VectorNTI軟件的Analysis功能分別對(duì)NZB、NZW、C57BL/6（參考序列NM_134248.2）小鼠Tim-1編碼蛋白序列的胞漿區(qū)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。
　　二、攜帶NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1編碼序列的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

6、
　?。ㄒ唬㎞ZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1基因編碼序列(CodingDNASequence，CDS)的擴(kuò)增
　　采用巢式PCR的方法，對(duì)NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1基因編碼序列(CDS)進(jìn)行擴(kuò)增。
　?。ǘCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1/myc-hisA真核表達(dá)質(zhì)粒
　　通過(guò)中間媒介T載體，最終將上述PCR產(chǎn)物分別克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA。構(gòu)建成功后

7、進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切及測(cè)序鑒定。
　　三、攜帶NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1編碼序列的重組真核質(zhì)粒的表達(dá)
　　將攜帶NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1編碼序列的重組質(zhì)粒通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染293T和DC2.4細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒組和PMAX-GFP組，轉(zhuǎn)染后流式檢測(cè)各重組質(zhì)粒在293T和DC2.4細(xì)胞中的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Ti

8、m-1cDNA的生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　NZB小鼠Tim-1cDNA較參考序列缺失了793-925位置的共132個(gè)堿基，其
　　中包括了771-773位置的終止密碼子TGA，同時(shí)925以后的堿基序列向前補(bǔ)充了空缺的位置，并形成了一個(gè)以913-915的TAA為終止密碼的新的開放讀碼區(qū)(ORF)，這種改變導(dǎo)致其編碼蛋白對(duì)應(yīng)于參考序列中293-299位置的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(RAEDNIY)丟失。
　　2、成功構(gòu)建攜帶NZ