利用吡唑類(lèi)衍生物研究體外缺血模型下血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成機(jī)制.pdf

1、研究背景和研究目的：
　　 缺血性疾病是動(dòng)脈供血不足或障礙引起來(lái)的一系列疾病，主要包括周?chē)鷦?dòng)脈閉塞性疾病(PAOD)、缺血性心臟疾病以及缺血性腦血管疾病等。PAOD又包括動(dòng)脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎、動(dòng)脈血栓形成、動(dòng)脈栓塞等疾病。PAOD作為血管外科的常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有較高的發(fā)病率、致殘率和致死率。缺血也常發(fā)生在心臟或腦，危險(xiǎn)性就更大，可引起患者猝死。對(duì)許多缺血性疾病的患者來(lái)說(shuō)，利用腔內(nèi)修復(fù)技術(shù)或外科開(kāi)放手術(shù)進(jìn)行血管的重建

2、，并同時(shí)將各種危險(xiǎn)因素降到最低，有時(shí)并不能完全拯救肢體、臟器并緩解缺血性靜息痛。因此，在過(guò)去的20年里，以促進(jìn)缺血部位新生血管形成及側(cè)支重建為目的的治療性策略及方法得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。換言之，治療性血管生成對(duì)這些缺血性患者具有十分重要的價(jià)值。促進(jìn)血管生成確實(shí)能夠減輕缺血對(duì)組織及器官的損害，促進(jìn)缺血狀態(tài)下的血管生成對(duì)一些介入或手術(shù)難以解決的患者來(lái)說(shuō)具有極其重要的臨床意義。許多缺血性疾病如冠狀動(dòng)脈缺血性疾病、腦梗塞及肢體缺血性疾病都可以從治療

3、性血管生成中獲益。但是，異?；蜻^(guò)多的血管形成能促進(jìn)腫瘤的血管形成及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)缺血狀態(tài)下的血管生成調(diào)控機(jī)制的更深層次的探索對(duì)我們的臨床實(shí)踐是十分必要的。如果我們對(duì)血管生成的分子機(jī)制有了更好的了解，就可以根據(jù)人類(lèi)自身的需要在不同的情況下通過(guò)調(diào)控這些機(jī)制來(lái)促進(jìn)或抑制血管生成。
　　 利用細(xì)胞滲透性小分子干擾生物現(xiàn)象進(jìn)行的研究稱(chēng)之為化學(xué)遺傳學(xué)，其在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域均發(fā)揮了非常重要之作用。有很多研究是利用化學(xué)遺傳學(xué)來(lái)尋找新

4、的小分子促血管生成劑；另外，這些小分子化合物也可作為闡明血管生成機(jī)制的工具。而且，它們也可以作為治療性血管形成的潛在藥物。有大量的證據(jù)顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)與疾病過(guò)程中的血管生成密切相關(guān)，所以血管內(nèi)皮細(xì)胞是治療性血管生成非常有吸引力的靶點(diǎn)。血管生成的啟動(dòng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移密切相關(guān)，因此找到能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)血管生成的小分子化合物是至關(guān)重要的。
　　 體外生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在去除血清和生長(zhǎng)因子的狀態(tài)下，將會(huì)

5、逐漸脫離培養(yǎng)皿并走向凋亡，這個(gè)體外模型常用來(lái)模擬體內(nèi)缺血狀態(tài)并且已得到了廣泛的應(yīng)用。乙烷基3-(o-氯苯基)-5-甲基-1-苯基-1 H-吡唑-羧酸酯(MPD)是吡唑類(lèi)的衍生物，前期研究表明MPD在20和25 RM時(shí)可以抑制這個(gè)體外缺血模型下的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而且在5和10μM時(shí)并不影響該模型下血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存能力。所以我們進(jìn)一步研究在體外缺血模型下MPD能否在這四個(gè)濃度時(shí)促進(jìn)血管生成。
　　 在體內(nèi)，一氧化氮(NO)由一

6、氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸合成，NOS是一種鈣離子依賴(lài)性酶并且與血管生成密切相關(guān)。NO作為一種血管擴(kuò)張劑可以促進(jìn)小動(dòng)脈的生成(形成肌肉動(dòng)脈)和血管生成(形成新的血管主要是毛細(xì)血管)。NO的生物活性的降低是內(nèi)皮功能紊亂的一個(gè)標(biāo)記并且與一系列的血管功能紊亂有關(guān)如受損的血管生成、痙攣、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及PAOD有關(guān)。在體外NO可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成相關(guān)的特性包括遷移、生長(zhǎng)和形成管狀結(jié)構(gòu)。增強(qiáng)的NO生物活性可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞

7、的存活力進(jìn)而促進(jìn)缺血介導(dǎo)的血管生成。NO在血管生成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。所以，我們利用MPD進(jìn)一步研究NO在血管生成中的調(diào)控作用。
　　 活性氧(ROS)是普遍存在并且廣泛分布的活性分子并由氧分子的降解生成。它們通常在吞噬細(xì)胞針對(duì)抗原的防御機(jī)制的呼吸鏈中產(chǎn)生。最近，研究者發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可產(chǎn)生ROS，并且它們與內(nèi)皮的功能紊亂密切相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化及缺血-再灌注損傷等。ROS參與凋亡并證明是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。在體外，R

8、OS促進(jìn)血管生成。在體內(nèi)，ROS水平的提高與動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈斑塊中的新生血管形成及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)密切相關(guān)。因此，ROS無(wú)論是對(duì)體內(nèi)還是體外血管生成過(guò)程中都具有重要的作用。ROS是在受到低氧、缺血及促血管生長(zhǎng)因子如VEGF和血管生成素等的刺激而產(chǎn)生的。但是，ROS是否參與MPD調(diào)節(jié)的血管生成過(guò)程尚不明了。
　　 干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(CXCL10/IP-10)是CXC趨化因子家族中的重要成員，可由活化的內(nèi)皮

9、細(xì)胞、單核細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及角化細(xì)胞等多種細(xì)胞生成。IP-10是一種強(qiáng)有力的血管生成抑制劑。IP-10在體外可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且IP-10可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)與VEGF的生成呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。如果將IP-10作用于在Matrigel基質(zhì)上培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，它將以濃度依賴(lài)模式抑制內(nèi)皮細(xì)胞向管狀結(jié)構(gòu)分化并且減少新生血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。IP-10在動(dòng)物模型中也可抑制新生血管生成?？偠灾?，IP-10不論在體內(nèi)還是體外均具有明顯的抗血管生成

10、作用。另有證據(jù)顯示，這種趨化因子與心血管疾病及冠脈綜合征的發(fā)病相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)顯示這種趨化因子在感染性及非感染性疾病中均可導(dǎo)致?lián)p傷；并且IP-10水平與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。我們的模型是模仿體內(nèi)缺血狀態(tài)。然而，IP-10是否與缺血狀態(tài)相關(guān)，并且是否在調(diào)節(jié)血管生成的過(guò)程中發(fā)揮作用，目前仍不清楚。
　　 從化學(xué)遺傳學(xué)的角度，利用小分子化合物可以發(fā)現(xiàn)參與血管生成的關(guān)鍵因子，因此可為闡明血管生成的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。然而，血管內(nèi)皮細(xì)胞

11、在體外缺血模型下參與血管生成的調(diào)控機(jī)理還沒(méi)有得到很好的闡明，仍然有待于進(jìn)一步研究。本論文旨在利用MPD作為研究工具回答上述科學(xué)問(wèn)題，明確NO，ROS和IP-10在血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成調(diào)控過(guò)程中的作用及其作用機(jī)理，為闡明血管生成的調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為缺血性疾病的治療性血管生成提供潛在的藥物，同時(shí)為缺血性疾病的治療提供新的線索和靶點(diǎn)。
　　 研究?jī)?nèi)容：
　　 1.研究MPD能否在體外缺血模型下(去除血清與生長(zhǎng)因子的

12、條件下)抑制VEC凋亡
　　 2.研究MPD能否在體外缺血模型下促進(jìn)血管生成
　　 3.MPD抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制研究研究方法
　　 1.血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的提取和培養(yǎng)參考Jaffe et al的方法[Jaffe EA et al，1973]
　　 2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：1)利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化2)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率3)吖啶橙染色結(jié)合(激光掃描)

13、共聚焦顯微鏡觀察，檢測(cè)細(xì)胞核凝集及片斷化
　　 3.體外血管形成檢測(cè)：利用Matrigel方法，參考[K.ureishi Y et al，2000]
　　 4.體外細(xì)胞遷移(劃傷)檢測(cè)：即平面單層細(xì)胞損傷愈合實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合倒置相差顯微鏡觀察，參考[Bürk，1973；Vasvari et al，2007]
　　 5.NO含量的檢測(cè)：利用NO檢測(cè)試劑盒
　　 6.ROS檢測(cè)：利用熒光探針(DCHF)并結(jié)合(激

14、光掃描)共聚焦顯微術(shù)檢測(cè)
　　 7.細(xì)胞內(nèi)蛋白分布及表達(dá)水平檢測(cè)：
　　 1)免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合(激光掃描)共聚焦顯微監(jiān)測(cè)技術(shù)，檢測(cè)Alix蛋白的表達(dá)水平及分布
　　 2)Western blot方法，檢測(cè)Alix，Ets-1和IP-10蛋白的表達(dá)水平
　　 研究結(jié)果：
　　 1.MPD抑制去除血清和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡MPD(20和25μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，倒置相差顯微鏡下，能

15、顯著抑制體外缺血模型誘導(dǎo)的HUVEC的凋亡。MPD(5和10μM)處理細(xì)胞24 h，相差顯微鏡下觀察，對(duì)體外缺血模型誘導(dǎo)的HUVEC的凋亡無(wú)影響。倒置相差顯微鏡下觀察，可見(jiàn)凋亡小體明顯變少；同樣吖啶橙染色顯示，MPD可抑制染色質(zhì)凝集和細(xì)胞核片斷化。
　　 2.MPD在體外缺血模型下促進(jìn)血管生成
　　 2.1體外Matrigel毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)顯示，去除血清和FGF-2條件下，MPD(5和10μM)在6，12和24

16、h時(shí)能顯著促進(jìn)血管生成即促進(jìn)VEC在Matrigel基質(zhì)上形成管狀結(jié)構(gòu)(*p<0.05 or**p<0.01)。MPD(20和25μM)在6，12和24 h時(shí)不能在Matrigel基質(zhì)上很好地形成管狀結(jié)構(gòu)。
　　 2.2單層細(xì)胞損傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示，MPD(5和10μM)在6，12和24 h顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移(*p<0.05 or**p<0.01)，并且在24 h，這個(gè)間隙幾乎愈合。MPD(20和25μM)在6，12和24 h并不能明

17、顯促進(jìn)細(xì)胞遷移。
　　 3.MPD抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制
　　 3.1 MPD(5，10和25μM)處理細(xì)胞6，12和24 h，MPD在5和10μM時(shí)可以在6和12 h時(shí)顯著升高細(xì)胞外液中NO水平(*p<0.05)，并且MPD在25μM時(shí)可以在6和12 h時(shí)極其顯著升高細(xì)胞外液中NO水平(**p<0.01)。而MPD在5，10和25μM時(shí)在24 h均不引起細(xì)胞外液中NO水平的變化(p>0.05)。<

18、br>　　 3.2 MPD(5，10和25μM)處理細(xì)胞6，12和24 h，與對(duì)照組相比，MPD在5和10μM時(shí)可以在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p<0.05)，而MPD在25μM時(shí)可以在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p<0.05)。
　　 3.3 Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MPD(5，10和25μM)處理細(xì)胞6，12和24 h，MPD在5，10和25μM時(shí)在24 h均顯著降低細(xì)胞內(nèi)IP-10水平(*p<

19、0.05)。而MPD在5，10和25μM時(shí)在6和12 h均不引起細(xì)胞內(nèi)IP-10水平的變化(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.MPD在體外缺血模型下能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并有效促進(jìn)血管生成。
　　 2.在體外缺血模型下，MPD在5和10μM時(shí)通過(guò)上調(diào)NO水平、ROS水平和抑制IP-10水平而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成。MPD在25μM時(shí)通過(guò)極其顯著上調(diào)NO水平、抑制ROS水平和IP-10水平而抑制

20、細(xì)胞凋亡。
　　 4.ROS和NO之間有密切聯(lián)系且均與細(xì)胞凋亡和血管生成相關(guān)。MPD很可能通過(guò)影響這一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相關(guān)因子，即控制ROS和NO的水平，在不同濃度抑制了去除血清和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的VEC凋亡并促進(jìn)了血管形成。
　　 4.MPD能夠抑制IP-10的表達(dá)，而且IP-10能夠抑制血管形成并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪且环N體外缺血疾病模型。所以，理論上講，MPD能夠抑制缺血對(duì)機(jī)體的損害，可作為缺血性疾病