肝癌中c-Myc介導(dǎo)的microRNA-101表觀沉默機(jī)制及功能研究.pdf

1、【背景】
　　MicroRNA(miRNA)分子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼小RNA分子,它的廣泛下調(diào)是包括肝癌在內(nèi)的眾多腫瘤的一個(gè)顯著特征。miRNA分子可通過(guò)序列特異性的互補(bǔ)識(shí)別,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA的翻譯或?qū)⑵浣到鈦?lái)負(fù)性調(diào)控下游基因。miRNA分子在進(jìn)化上的高度保守性,提示了其可能在生命功能的諸多方面發(fā)揮重要功能。據(jù)推測(cè),存在于人體內(nèi)的超過(guò)1000種的miRNA可以調(diào)控近三分之一編碼蛋白基因的表

2、達(dá),影響著幾乎所有的信號(hào)通路。因此,肝癌中抑癌 miRNA分子廣泛下調(diào)的直接結(jié)果便是導(dǎo)致大量能促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的癌基因被活化。值得思考的是,目前的研究大多熱衷于挖掘腫瘤與正常組織中差異表達(dá)的miRNA,進(jìn)而研究其功能,卻忽視了探尋導(dǎo)致這些miRNA異常表達(dá)的原因。如果能闡明肝癌中抑癌miRNA廣泛下調(diào)的具體機(jī)理,將其作為靶點(diǎn)來(lái)逆轉(zhuǎn),那么將會(huì)為肝癌的臨床治療提供一種全新的有力武器。
　　癌基因EZH2在多種腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮了極為

3、關(guān)鍵的作用。研究顯示,EZH2不僅能沉默許多抑癌基因的表達(dá),甚至在miRNA分子下調(diào)的過(guò)程中也扮演了重要角色。然而,關(guān)于 EZH2是通過(guò)何種機(jī)制來(lái)特異性沉默抑癌基因的目前仍不清楚。在肝癌中EZH2是否會(huì)和一些致癌性轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)作來(lái)控制抑癌miRNA的表達(dá)?在這個(gè)過(guò)程中具體有哪些關(guān)鍵的miRNA受到了影響?它們發(fā)揮的作用又是什么?這些問(wèn)題目前都尚不清楚,本課題將就此展開(kāi)研究。
　　【目的】
　　鑒定肝癌細(xì)胞中與 EZH2相互

4、作用的致癌性轉(zhuǎn)錄因子,并篩選出同時(shí)受 EZH2和該轉(zhuǎn)錄因子抑制的抑癌miRNA分子,進(jìn)而探討這些miRNA發(fā)生沉默的具體表觀遺傳學(xué)機(jī)制及其在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用與功能,為肝癌的預(yù)防、早期診斷以及治療靶點(diǎn)的選擇提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2中EZH2相關(guān)復(fù)合物的組分進(jìn)行分析,找到與之相互作用的致癌性轉(zhuǎn)錄因子;2.用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)c-Myc與EZH2蛋白的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證,并

5、分析c-Myc與EZH2蛋白結(jié)合所需的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;3.通過(guò)miRNA芯片技術(shù)分析c-Myc或EZH2下調(diào)后HepG2細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,篩選出同時(shí)受這兩種基因抑制的miRNA分子,用qRT-PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;4.采用表觀遺傳學(xué)藥物5-Aza-CdR和TSA對(duì)肝癌細(xì)胞系(HepG2與SMMC-7721)進(jìn)行處理,用qRT-PCR分析表觀遺傳調(diào)控對(duì)miR-101表達(dá)的影響;5.通過(guò)5’-RACE的方法確定miR-101前體的轉(zhuǎn)錄

6、起始位點(diǎn)(TSS),并運(yùn)用重亞硫酸鹽直接測(cè)序技術(shù)分析miR-101啟動(dòng)子區(qū)DNA的甲基化修飾水平;6.采用針對(duì)EZH2酶活性的小分子抑制劑 DZNep或特異性靶向 c-Myc/EZH2的siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞 HepG2進(jìn)行處理,用qRT-PCR分析c-Myc以及EZH2酶活性對(duì)miR-101(前體及成熟形式)表達(dá)的影響;7.通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀聯(lián)合qRT-PCR(ChIP-qPCR)的方法檢測(cè)c-Myc以及PRC2各組分在 miR-101

7、啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況;8.利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析 c-Myc和EZH2對(duì)miR-101啟動(dòng)子活性的影響;9.通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞血管新生實(shí)驗(yàn)以及裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)分析 miR-101對(duì)肝癌細(xì)胞多種惡性表型的影響;10.聯(lián)合運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-101潛在的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并將預(yù)測(cè)的靶基因用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能聚類分析;11.利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定miR-101直接調(diào)控的靶

8、基因,并用Western Blot實(shí)驗(yàn)在蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證;12.利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子ELISA以及內(nèi)皮細(xì)胞血管新生實(shí)驗(yàn)分析miR-101是否通過(guò)調(diào)控下游靶基因STMN1、CXCR7和JUNB來(lái)影響肝癌細(xì)胞的惡性表型;13.采用成熟形式miR-101的mimics對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行轉(zhuǎn)染,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-101前體水平的改變來(lái)觀察外源性miR-101對(duì)其內(nèi)源性表達(dá)

9、的影響;14.通過(guò)miRNA原位雜交和免疫組織化學(xué)的方法分析裸鼠荷瘤組織與肝癌臨床樣品組織中miR-101、c-Myc、EZH2、EED、JUNB、STMN1及CXCR7的表達(dá)情況,并用qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些分子在3例正常肝組織與7例肝癌組織中的表達(dá)水平,分析miR-101和這些基因的臨床相關(guān)性;15.通過(guò)qRT-PCR和免疫組織化學(xué)的方法對(duì)包含54例肝癌臨床樣品的組織芯片進(jìn)行檢測(cè),分析c-Myc和EZH2

10、異常表達(dá)對(duì)miR-101水平的影響,并采用c-Myc與EZH2雙分子聯(lián)合對(duì)這群肝癌病人的預(yù)后進(jìn)行分析。
　　【結(jié)果】
　　1.質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示,在肝癌細(xì)胞HepG2中,EZH2相關(guān)復(fù)合物中不僅包含了 PRC2的其他組分,而且還含有一個(gè)重要的致癌性轉(zhuǎn)錄因子 c-Myc;2.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-Myc與EZH2確實(shí)能夠發(fā)生相互作用,并且這種作用依賴于c-Myc蛋白的MBII和bHLH-LZ結(jié)構(gòu)域;3. miRNA芯片結(jié)果顯示

11、,miR-101等10種miRNA在肝癌細(xì)胞HepG2中同時(shí)受到c-Myc和EZH2的抑制,qRT-PCR證實(shí)在干涉c-Myc或EZH2后miR-101的表達(dá)確實(shí)發(fā)生上調(diào),鑒于miR-101在正常肝組織中的高豐度和在肝癌組織中的低表達(dá),選擇miR-101進(jìn)行深入研究;4. qRT-PCR結(jié)果顯示,聯(lián)合使用表觀遺傳學(xué)藥物5-Aza-CdR和TSA對(duì)肝癌細(xì)胞系(HepG2與SMMC-7721)進(jìn)行刺激能顯著上調(diào)其miR-101的表達(dá)水平,而

12、單獨(dú)使用則對(duì)miR-101的表達(dá)無(wú)明顯影響;5.5’-RACE的結(jié)果顯示,miR-101-1的TSS位于其成熟序列上游9.3 kb的地方,并且在其原始轉(zhuǎn)錄本形成的過(guò)程中發(fā)生了剪接,而miR-101-2的TSS則緊鄰其成熟序列,進(jìn)一步的重亞硫酸鹽測(cè)序發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞中 miR-101啟動(dòng)子區(qū)并未發(fā)生顯著的高甲基化;6. qRT-PCR結(jié)果顯示,干涉c-Myc或EZH2后,肝癌細(xì)胞HepG2中miR-101前體的水平會(huì)顯著上升,而用DZNep

13、抑制EZH2酶活性之后也能有效上調(diào)前體及成熟形式miR-101的表達(dá);7. ChIP-qPCR結(jié)果顯示,c-Myc、EZH2和EED在 miR-101啟動(dòng)子區(qū)有特異的結(jié)合信號(hào)且結(jié)合模式非常相似,同時(shí)該區(qū)域也能檢測(cè)到較強(qiáng)的H3K27me3修飾信號(hào);8.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,c-Myc和EZH2能夠協(xié)同發(fā)揮作用來(lái)抑制 miR-101啟動(dòng)子的活性;9.體內(nèi)及體外的功能研究表明, miR-101能顯著抑制肝癌細(xì)胞的非錨定依賴性生長(zhǎng)能力、轉(zhuǎn)移

14、侵襲能力、促血管新生能力以及成瘤能力;10.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提示,miR-101可能通過(guò)抑制下游的EZH2、EED、JUNB、STMN1、CXCR7等基因來(lái)影響染色質(zhì)重塑、血管新生、細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移等過(guò)程;11.熒光素酶報(bào)告基因與Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí),EZH2、EED、JUNB、STMN1和CXCR7確實(shí)是miR-101直接調(diào)控的下游靶基因;12.進(jìn)一步的體內(nèi)及體外功能研究表明,miR-101可通過(guò)抑制這些下游靶分子來(lái)逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)

15、胞多種相關(guān)惡性表型;13. qRT-PCR結(jié)果顯示,只需瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一次外源性miR-101就能顯著并持久地提升肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性miR-101前體的表達(dá);14. miRNA原位雜交及免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示,在裸鼠荷瘤組織與肝癌臨床樣品組織中miR-101的表達(dá)缺失,而c-Myc、EZH2、EED、JUNB、STMN1、CXCR7則是異常高表達(dá),進(jìn)一步對(duì)3例正常肝組織及7例肝癌組織的分析發(fā)現(xiàn),miR-101與這些分子的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān);1

16、5.肝癌組織芯片的分析結(jié)果顯示,c-Myc和EZH2同時(shí)高表達(dá)的肝癌組織中miR-101水平最低且患者的預(yù)后最差,而c-Myc和EZH2都不表達(dá)的肝癌組織中miR-101水平則相對(duì)較高并且患者的預(yù)后也最好。
　　【結(jié)論】
　　1.在肝癌細(xì)胞中,癌基因c-Myc首先結(jié)合到miR-101的啟動(dòng)子區(qū)并募集以EZH2為核心的PRC2復(fù)合物,進(jìn)而催化組蛋白發(fā)生H3K27me3的修飾,最終導(dǎo)致miR-101的表觀遺傳學(xué)沉默;2. miR