結(jié)直腸鋸齒狀病變中p16及MLH-1基因甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、[背景與目的]
　　新版WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中,將結(jié)直腸鋸齒狀病變定義為一種以上皮呈鋸齒狀結(jié)構(gòu)為特點(diǎn)的病變,可分為增生性息肉(hyperplastic polyps,HPs)、廣基鋸齒狀腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)。HP為鋸齒狀病變中最常見(jiàn)的病變,約占80％~90%,根據(jù)組織學(xué)

2、上的粘液類(lèi)型分為微泡型HP(microvesicular hyperplastic polyp,MVHP)、富于杯狀細(xì)胞型HP(goblet-cell rich hyperplastic polyp,GCHP)及黏液缺乏型HP(mucin-poor type polyp,MPHP)。SSA/P占鋸齒狀病變的15%~25%,根據(jù)細(xì)胞異型性分為伴/不伴有細(xì)胞異型增生型。TSA占鋸齒狀病變的1%~6%左右,研究表明TSA具有惡變?yōu)榻Y(jié)直腸癌的潛

3、能,但它的鋸齒狀癌變通路存在爭(zhēng)議。鋸齒狀病變是繼經(jīng)典型腺瘤后最重要的結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)癌前病變類(lèi)型,具有發(fā)展為 CRC的惡性潛能。近年來(lái)新認(rèn)識(shí)到它與部分散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生緊密相關(guān),被認(rèn)為是CRC除“腺瘤-癌變”途徑和“denove癌”途徑之外的一種新途徑,即鋸齒狀通路。有文獻(xiàn)提出[8],鋸齒狀病變通路與DNA甲基化密切相關(guān),鋸齒狀通路中關(guān)鍵的啟動(dòng)因素就是DNA甲基化。因此相關(guān)基因甲基化在鋸齒狀病變中

4、的研究應(yīng)當(dāng)引起重視。
　　本文分別探討鋸齒狀病變中的p16及 MLH-1基因的甲基化狀態(tài)。p16基因定位于人類(lèi)第9號(hào)染色體短臂21上,是一種重要的抑癌基因。 p16基因失活,可使細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。甲基化所可引起的p16基因的沉默,是人類(lèi)腫瘤中較常發(fā)生的基因改變。但目前有關(guān)鋸齒狀病變與 p16基因甲基化相關(guān)的研究很少。MLH-1是人類(lèi)錯(cuò)配修復(fù)基因(mismatch repairgene,MMR)家族中的成員,是

5、腫瘤錯(cuò)配修復(fù)基因中最為重要的基因,MLH-1基因啟動(dòng)子甲基化可使該基因沉默,是導(dǎo)致散發(fā)性 CRC MMR缺陷的主要原因[7]。新近的研究指出,鋸齒狀癌變通路可能有兩條途徑[4],其中一條稱(chēng)為無(wú)蒂(廣基)鋸齒狀癌變途徑,主要為BRAF基因突變,引起MLH-1基因甲基化和高水平CpG島甲基化現(xiàn)象,最終導(dǎo)致腺體不同程度異型增生直至癌變。可見(jiàn),MLH-1基因啟動(dòng)子甲基化是鋸齒狀病變惡變過(guò)程中的重要事件。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Taqman探針實(shí)時(shí)

6、定量PCR(MethyLight)和免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸鋸齒狀病變患者組織中 p16、MLH-1基因甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)情況,分析其甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)情況兩者的相關(guān)性,從而探討p16和MLH-1基因在鋸齒狀癌變通路中的作用及臨床病理意義。同時(shí)研究鋸齒狀病變中p16和MLH-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和年齡因素的相關(guān)情況,探討其在不同年齡層段基因甲基化程度。
　　[方法]
　　收集2007-01-01-2012-12-31其

7、間北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科結(jié)腸鏡活檢診斷為結(jié)直腸息肉和腺瘤的切片共4810例,由3名病理醫(yī)師按WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)進(jìn)行多輪回顧性閱片。然后篩選出鋸齒狀病變標(biāo)本225例作為實(shí)驗(yàn)組,其中包括96例HP、61例SSA/P和68例TSA;同時(shí),收集同院同期的管狀腺瘤(Tubular adenoma,TA)54例、69例CRC和正常結(jié)直腸組織42例作為對(duì)照;并收集其相關(guān)臨床及內(nèi)窺鏡資料。提取組織DNA,然后進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾,采用Taq

8、man探針實(shí)時(shí)定量
　　PCR(MethyLight)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的p16和MLH-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),并通過(guò)測(cè)序法驗(yàn)證擴(kuò)增的目的片段,同時(shí)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)其中隨機(jī)抽取的116例鋸齒狀病變(52例HP、41例SSA/P、23例TSA)、20例TA、24例CRC和24例正常結(jié)直腸黏膜組織中p16和MLH-1蛋白的表達(dá)水平,最后,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)p16和MLH-1基因甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)水平及臨床病理學(xué)資料進(jìn)行

9、分析。
　　[結(jié)果]
　　1.各組織p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)、蛋白表達(dá)及兩者相關(guān)性檢測(cè):p16基因啟動(dòng)子甲基化率在正常(2.38%)、HP(21.88%)、TA(35.19%)、SSA/P(42.62%)和TSA(52.94%)呈上升趨勢(shì)。HP和正常組織、SSA/P、TSA及CRC有顯著性差異(P<0.05),HP和TA差異性不顯著(P>0.05);SSA/P與正常及HP有顯著性差異(P<0.05);TSA與正常及HP有

10、顯著性差異(P<0.05),TSA、TA、SSA/P、CRC四者相互之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組織免疫組化 p16陽(yáng)性表達(dá)率:p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在正常、TA、HP、SSA/P、TSA、CRC分別為91.67%、40.00%、44.23%、31.71%、21.74%、29.17%。正常組與HP、SSA/P、TSA、TA、CRC組之間有顯著性差異(P<0.05),其余各組差異性都不顯著(P>0.05)。各組織p16基因甲基化與

11、p16蛋白相關(guān)性分析:TA、SSA/P、TSA、CRC四組中p16基因甲基化與其蛋白表達(dá)結(jié)果均有顯著性差異(P<0.05),且相關(guān)性為負(fù)相關(guān);HP中p16基因甲基化與p16蛋白表達(dá)結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05),相關(guān)性為負(fù)相關(guān);正常組織中無(wú)相關(guān)性。各組織 p16基因甲基化與年齡相關(guān)性分析:TA、HP、SSA/P、TSA四組中p16基因甲基化與年齡均有顯著性差異(P<0.05),且相關(guān)性為正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為γ=0.303、γ=0.2

12、22、γ=0.576、γ=0.530。
　　2.各組織 MLH-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、蛋白表達(dá)及兩者相關(guān)性檢測(cè):MLH-1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性表達(dá)率在正常、TA、HP、SSA/P、TSA和CRC分別為9.24%、40.74%、22.92%、45.90%、61.76%和52.17%。HP與正常、SSA/P、TSA、CRC有顯著性差異(P<0.05),SSA/P與正常有顯著性差異(P<0.05),TSA與正常有顯著性差異(P<0.0

13、5);HP和TA無(wú)顯著性差異(P>0.05)。TSA、TA、SSA/P、CRC四者相互之間均無(wú)顯著性差異。各組織 MLH-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為正常(100%)、HP(98.08%)、TA(80.0%)、SSA/P(75.61%)、TSA(69.57%)和CRC(70.83%)。正常與HP、SSA/P、TSA、TA、CRC之間有顯著性差異(P<0.05),HP與TA、 SSA/P、TSA、CRC組之間有顯著性差異(P<0.05),其余各

14、組差異性都不顯著(P>0.05)。各組織MLH-1基因甲基化與其蛋白相關(guān)性分析:TA、SSA/P、TSA三組中 MLH-1基因甲基化與其蛋白表達(dá)均有顯著性差異(P<0.05),且相關(guān)性為負(fù)相關(guān);HP和CRC中 MLH-1甲基化與其蛋白表達(dá)結(jié)果均無(wú)顯著性差異(P>0.05),相關(guān)性為負(fù)相關(guān);正常組織中無(wú)相關(guān)性。各組織 MLH-1基因甲基化與年齡相關(guān)性分析:TA、HP、SSA/P、TSA四組中MLH-1基因甲基化與年齡均有顯著性差異(P<0

15、.05),且相關(guān)性為正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為γ=0.475、γ=0.289、γ=0.450、γ=0.575。
　　[結(jié)論]
　　1.結(jié)直腸鋸齒狀病變組織中p16和MLH-1基因甲基化率在HP、SSA/P、TSA中逐漸上升,p16和MLH-1基因甲基化可能是誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)減少的主要原因之一,且在鋸齒狀癌變通路中起重要作用,同時(shí)p16和MLH-1基因甲基化又可能與年齡相關(guān),隨年齡增長(zhǎng),甲基化程度越頻繁。
　　2.結(jié)直腸鋸齒狀

16、病變組織中p16和MLH-1基因甲基化率在HP、SSA/P、TSA中逐漸上升,SSA/P和TSA甲基化率與HP比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此,甲基化有助于HP和SSA/P、TSA的鑒別。
　　[背景與目的]
　　腫瘤是嚴(yán)重威害人類(lèi)健康的重大疾患,其中結(jié)直腸癌是發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高居各種惡性腫瘤的第三位。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多種基因參與的復(fù)雜過(guò)程,主要包括:抑癌基因的失活、基因組的超甲基化、癌基因的激活以及細(xì)胞間

17、粘附功能的降低等。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),成為目前研究的熱點(diǎn)。本文主要研究MLH-1和p16基因的甲基化與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。MLH-1是人類(lèi)錯(cuò)配修復(fù)基因(mismatch repairgene,MMR)家族中的成員,是腫瘤錯(cuò)配修復(fù)基因中最為重要的基因,主要功能為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期,并且使DNA的復(fù)制能夠正確的進(jìn)行。p16基因是人類(lèi)一種重要的抑癌基因,參與細(xì)胞周期調(diào)控,并在許多環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵性的“剎車(chē)”作用

18、。若MLH-1和p16基因失活,均可使細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　在結(jié)直腸癌中,基因啟動(dòng)子區(qū)域 DNA甲基化是遺傳外修飾調(diào)控的一種重要方式,它可引起基因表達(dá)沉默,從而下調(diào)基因表達(dá),導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1,2]。已有研究表明去甲基化藥物5'-氮雜-2'-脫氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine,5'-Aza-CdR)可以通過(guò)抑制基因高甲基化狀態(tài)而恢復(fù)多種基因的活性,具有潛在抗腫瘤作用[3,4]。本實(shí)驗(yàn)采

19、用去甲基化藥物5'-Aza-CdR作用于結(jié)直腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞系后,分別檢測(cè) MLH-1和p16基因甲基化狀態(tài)及其 mRNA和蛋白表達(dá)水平,驗(yàn)證其mRNA和蛋白表達(dá)水平是否恢復(fù),探討在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中應(yīng)用去甲基化藥物對(duì)MLH-1和p16基因甲基化的抑制作用,可能具有抗腫瘤生長(zhǎng)作用,以期為結(jié)直腸癌的預(yù)防、發(fā)生及治療提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　1.體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29、LoVo,選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好

20、的細(xì)胞接種于六孔板培養(yǎng),應(yīng)用不同濃度的5'-Aza-CdR(0.5、1.0、1.5μM)分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),并設(shè)置陰性對(duì)照組(僅加DMSO溶劑),每24小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,連續(xù)作用72h后,分別提取細(xì)胞的DNA、mRNA和蛋白。
　　2.應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR(Methylight)方法分別檢測(cè)兩種細(xì)胞株中MLH-1和p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),應(yīng)用SYBR Green PCR法分別檢測(cè)兩種細(xì)胞株中MLH-1和p

21、16基因mRNA的表達(dá),并結(jié)合2-△△Ct法進(jìn)行分析,應(yīng)用Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)兩種細(xì)胞株中MLH-1和p16基因蛋白表達(dá),并結(jié)合平均光密度比值進(jìn)行分析。
　　[結(jié)果]
　　1.結(jié)直腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞系中MLH-1和p16基因甲基化狀況:在陰性對(duì)照組(僅加DMSO溶液)和實(shí)驗(yàn)組(分別加0.5、1.0、1.5μM5'-Aza-CdR)中HT-29和LoVo細(xì)胞株中p16基因甲基化狀態(tài)分別都為甲基化、未甲

22、基化、未甲基化和未甲基化,MLH-1基因甲基化狀態(tài)分別都為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。2.結(jié)直腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞系中MLH-1和p16基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組有上調(diào),并且有藥物濃度的依賴性。
　　[結(jié)論]
　　15'-Aza-CdR能夠有效逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞系中MLH-1和p16基因甲基化狀態(tài),并且恢復(fù)其mRNA和蛋白的表達(dá)水平,從而可以證明結(jié)直腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞系中