大鼠肝癌細胞PEMT2過表達與cAMP信號分子的激活.pdf

1、磷脂酰膽堿(PC)是真核生物細胞膜上的重要的組分之一，其主要的合成途徑是CDP-膽堿通路。肝臟中除了CDP-膽堿通路外，還存在一條特有的PC生成通路，即磷脂酰乙醇胺(PE)甲基化通路。至今已經(jīng)知道有兩種不同的磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphatidlethanolamine N-methyltransferase，PEMT)催化其反應(yīng)：一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，稱之為PEMT1，另一種位于線粒體相關(guān)膜(mitochontria-assod

2、iated membrane)上，稱之為PEMT2。PEMT2是80年代末期發(fā)現(xiàn)并提純的一種存在于哺乳動物肝臟中的特異酶，因其在細胞內(nèi)的存在部位不同而區(qū)別于PEMT1。近年來發(fā)現(xiàn)，PEMT2在肝臟發(fā)育、再生肝中PC合成、肝細胞生長和凋亡中發(fā)揮重要的作用。在本室前期實驗中，將外源性的pemt2基因轉(zhuǎn)染到大鼠肝癌細胞系CBRH-7919中，建立了穩(wěn)定的過表達PEMT2細胞模型，發(fā)現(xiàn)PEMT2高表達可以明顯抑制大鼠肝癌細胞的增殖，并誘發(fā)肝癌細

3、胞凋亡。進一步的實驗表明，PEMT2過表達可以抑制PI3K-Akt-Bc12抗凋亡通路蛋白表達，激活caspase3等凋亡蛋白，抑制c-jun等原癌基因表達，從而使細胞周期G1/S期阻滯。但是，PEMT2過表達與細胞內(nèi)第二信使的激活關(guān)系并不十分清楚。
　　 環(huán)腺苷酸(cyclicadenosine monophosphate，cAMP)是第一個被鑒別的第二信使，廣泛存在于動物細胞內(nèi)。cAMP可將細胞外信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號，通過影響

4、轉(zhuǎn)錄因子的變化調(diào)控基因的表達。cAMP途徑可以調(diào)節(jié)和活化許多轉(zhuǎn)錄因子：包括cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)、cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)子(cAMP responseelement modulator，CREM)、NF-kB、核受體等，從而調(diào)控細胞的新陳代謝、增殖、分化、凋亡等過程。有研究表明cAMP作為肝細胞生長的負調(diào)節(jié)因子，下調(diào)細胞周期蛋白A(cyclinA)依賴

5、性激酶，控制細胞周期DNA的合成。
　　 本文主要以大鼠的原代培養(yǎng)肝細胞、肝癌細胞CBRH7919以及PEMT2過表達細胞為實驗對象，比較cAMP在不同細胞中的含量及活性等，旨在了解PEMT2過表達抑制細胞生長與cAMP的表達及活性的關(guān)系，為進一步闡明PEMT2抑制大鼠肝癌細胞的增殖，并誘發(fā)肝癌細胞凋亡的分子機制提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)培養(yǎng)大鼠肝癌細胞，利用基因轉(zhuǎn)染方法建立PEMT2高

6、表達細胞模型；分離大鼠的正常肝臟細胞，進行體外原代培養(yǎng)，檢測不同細胞內(nèi)PEMT2表達水平；
　　 (2)利用免疫細胞化學(xué)方法和3H-cAMP摻入法測定正常肝細胞、肝癌細胞、PEMT2過表達細胞中cAMP的含量及活性；
　　 (3)采用流式細胞儀檢測分析PEMT2過表達細胞和肝癌細胞的細胞周期DNA含量變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)PEMT2在原代培養(yǎng)的肝細胞內(nèi)表達最高，肝癌細胞中幾乎沒有表達，轉(zhuǎn)染細胞

7、(pp8)PEMT2表達明顯高于肝癌細胞。
　　 (2)cAMP在原代培養(yǎng)的肝細胞中表達較高，肝癌細胞中含量和活性均較低，PEMT2過表達可明顯提高肝癌細胞內(nèi)cAMP的活性和含量。
　　 (3)肝癌細胞處于旺盛的分裂階段，S期細胞比例很高；而PEMT2過表達細胞G1期細胞比例明顯增加，S期細胞比例明顯減少。
　　 結(jié)論：PEMT2過表達抑制大鼠肝癌細胞生長、促進凋亡與cAMP信號通路激活、細胞周期進程被抑制有關(guān)。