大鼠肝癌細(xì)胞PEMT2過表達(dá)與cAMP信號(hào)分子的激活.pdf

1、磷脂酰膽堿(PC)是真核生物細(xì)胞膜上的重要的組分之一，其主要的合成途徑是CDP-膽堿通路。肝臟中除了CDP-膽堿通路外，還存在一條特有的PC生成通路，即磷脂酰乙醇胺(PE)甲基化通路。至今已經(jīng)知道有兩種不同的磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphatidlethanolamine N-methyltransferase，PEMT)催化其反應(yīng)：一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，稱之為PEMT1，另一種位于線粒體相關(guān)膜(mitochontria-assod

2、iated membrane)上，稱之為PEMT2。PEMT2是80年代末期發(fā)現(xiàn)并提純的一種存在于哺乳動(dòng)物肝臟中的特異酶，因其在細(xì)胞內(nèi)的存在部位不同而區(qū)別于PEMT1。近年來發(fā)現(xiàn)，PEMT2在肝臟發(fā)育、再生肝中PC合成、肝細(xì)胞生長和凋亡中發(fā)揮重要的作用。在本室前期實(shí)驗(yàn)中，將外源性的pemt2基因轉(zhuǎn)染到大鼠肝癌細(xì)胞系CBRH-7919中，建立了穩(wěn)定的過表達(dá)PEMT2細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)PEMT2高表達(dá)可以明顯抑制大鼠肝癌細(xì)胞的增殖，并誘發(fā)肝癌細(xì)

3、胞凋亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，PEMT2過表達(dá)可以抑制PI3K-Akt-Bc12抗凋亡通路蛋白表達(dá)，激活caspase3等凋亡蛋白，抑制c-jun等原癌基因表達(dá)，從而使細(xì)胞周期G1/S期阻滯。但是，PEMT2過表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)第二信使的激活關(guān)系并不十分清楚。
　　 環(huán)腺苷酸(cyclicadenosine monophosphate，cAMP)是第一個(gè)被鑒別的第二信使，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。cAMP可將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號(hào)，通過影響

4、轉(zhuǎn)錄因子的變化調(diào)控基因的表達(dá)。cAMP途徑可以調(diào)節(jié)和活化許多轉(zhuǎn)錄因子：包括cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)、cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)子(cAMP responseelement modulator，CREM)、NF-kB、核受體等，從而調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝、增殖、分化、凋亡等過程。有研究表明cAMP作為肝細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白A(cyclinA)依賴

5、性激酶，控制細(xì)胞周期DNA的合成。
　　 本文主要以大鼠的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞CBRH7919以及PEMT2過表達(dá)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較cAMP在不同細(xì)胞中的含量及活性等，旨在了解PEMT2過表達(dá)抑制細(xì)胞生長與cAMP的表達(dá)及活性的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明PEMT2抑制大鼠肝癌細(xì)胞的增殖，并誘發(fā)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)培養(yǎng)大鼠肝癌細(xì)胞，利用基因轉(zhuǎn)染方法建立PEMT2高

6、表達(dá)細(xì)胞模型；分離大鼠的正常肝臟細(xì)胞，進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)PEMT2表達(dá)水平；
　　 (2)利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和3H-cAMP摻入法測(cè)定正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、PEMT2過表達(dá)細(xì)胞中cAMP的含量及活性；
　　 (3)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析PEMT2過表達(dá)細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期DNA含量變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)PEMT2在原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最高，肝癌細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞

7、(pp8)PEMT2表達(dá)明顯高于肝癌細(xì)胞。
　　 (2)cAMP在原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞中表達(dá)較高，肝癌細(xì)胞中含量和活性均較低，PEMT2過表達(dá)可明顯提高肝癌細(xì)胞內(nèi)cAMP的活性和含量。
　　 (3)肝癌細(xì)胞處于旺盛的分裂階段，S期細(xì)胞比例很高；而PEMT2過表達(dá)細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯減少。
　　 結(jié)論：PEMT2過表達(dá)抑制大鼠肝癌細(xì)胞生長、促進(jìn)凋亡與cAMP信號(hào)通路激活、細(xì)胞周期進(jìn)程被抑制有關(guān)。