共培養(yǎng)DC-LAK細(xì)胞抗腫瘤作用及經(jīng)不同途徑回輸后在荷瘤小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布.pdf

1、目的：本試驗(yàn)采用小鼠肺癌腫瘤模型為研究對(duì)象。取小鼠骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)，用腫瘤抗原活化DC成熟，與小鼠脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)細(xì)胞的抗腫瘤能力及回輸體內(nèi)后的組織器官分布特點(diǎn)。為今后在臨床聯(lián)合應(yīng)用DC和LAK細(xì)胞治療肺癌提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1培養(yǎng)小鼠肺癌腫瘤細(xì)胞株Le

2、wis lung carcinoma(LLC)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107/ml。以C57BL/6小鼠右側(cè)前肢腋下為注射部位，皮下注射單細(xì)胞懸液0.2ml，以建立小鼠腫瘤模型。 2取小鼠腫瘤組織，應(yīng)用反復(fù)凍融法制備腫瘤抗原，使用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行LLC腫瘤抗原蛋白定量。 3.DC與LAK細(xì)胞的體外培養(yǎng)。從C57BL/6小鼠脛骨與股骨獲得骨髓細(xì)胞，用含有rmGM-CM-CSF 50ng/

3、ml和rmIL-4 25ng/ml的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天半量換液，并加相應(yīng)細(xì)胞因子。培養(yǎng)至第七天的DC，加入LLC腫瘤抗原100mg/ml，48h后，收獲懸浮細(xì)胞，為活化DC。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD80、CD86的表達(dá)情況。于C57BL/6小鼠獲得脾臟，過(guò)400目鋼網(wǎng)制備脾細(xì)胞懸液。利用梯度離心法收獲脾淋巴細(xì)胞。用含rmIL-21000iu/ml的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至第七天，收獲細(xì)胞為L(zhǎng)AK細(xì)胞。 4.DC-

4、LAK的共同培養(yǎng)。收獲的活化DC與LAK細(xì)胞，按1:5的比例混合，加入rmIL-2 500iu/ml、rmGM-CSF25ng/ml、rmIL-4 12.5ng/ml培養(yǎng)48h后收集，為共培養(yǎng)DC-LAK細(xì)胞。 5共培養(yǎng)DC-LAK體外殺傷實(shí)驗(yàn)。效應(yīng)細(xì)胞為L(zhǎng)AK細(xì)胞組和與腫瘤抗原致敏DC共培養(yǎng)LAK細(xì)胞(DC-LAK)，靶細(xì)胞為L(zhǎng)LC細(xì)胞，分別按效靶比20:1、40:1的條件下用MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞的殺傷活性。 6回輸外

5、源性殺傷細(xì)胞。荷瘤C57BL/6小鼠48只，于注射LLC后10天，回輸經(jīng)CFSE標(biāo)記的外源性殺傷細(xì)胞。荷瘤小鼠隨機(jī)分為瘤旁皮下注射和腹腔注射2組，各組再隨機(jī)分為DC-LAK組與LAK組，各組再隨機(jī)分為4組(1h、4h、24h、72h)，每組3只，每只分別經(jīng)瘤旁皮下注射或腹腔注射CFSE標(biāo)記的DC-LAK細(xì)胞或LAK細(xì)胞3×107/0.2ml。7外源性殺傷細(xì)胞體內(nèi)分布的檢測(cè)。各組荷瘤小鼠分別于回輸外源性殺傷細(xì)胞后1h、4h、24h、72h

6、，取外周血、肝臟、脾臟、肺臟與腫瘤。肝臟、脾臟、肺臟與皮下腫瘤過(guò)200目鋼網(wǎng)，加入與原重量相等的PBS重懸。外周血按體積用PBS1:1稀釋。處理好的血，肝臟，脾臟，肺臟與皮下腫瘤各樣本取10μl，滴于載玻片上，上覆蓋玻片，每個(gè)樣本滴片3張。激光共聚焦熒光顯微鏡(Iaser scanning confocal microscope，LSM)下觀察成像(激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，熒光信號(hào)的檢測(cè)通道為505nm的長(zhǎng)通濾光片)。于400倍視野下觀察

7、，每張玻片隨機(jī)選取10個(gè)視野，采集圖像，計(jì)數(shù)圖像中綠色熒光細(xì)胞。以3張玻片均數(shù)記為該樣本陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果： 1小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)9天后表面突起多樣化，細(xì)胞呈樹(shù)突狀。平均每只小鼠收獲DC6×106個(gè)。經(jīng)LLC腫瘤凍融抗原活化的DC，其表面CD80表達(dá)率為42.4％，CD86表達(dá)率為75.31％，CD80CD86共表達(dá)率為41.36％。 2.DC和LAK細(xì)胞混合培養(yǎng)48h.后形成DC-LAK細(xì)胞簇，少則數(shù)個(gè)細(xì)胞，多則

8、數(shù)十個(gè)細(xì)胞。 3外源性殺傷細(xì)胞對(duì)小鼠LLC肺癌細(xì)胞的體外殺傷活性。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞為40:1時(shí)，單純LAK細(xì)胞組殺傷活性為(63.45±2.46％)，而經(jīng)LLC細(xì)胞抗原致敏的DC能誘導(dǎo)出LAK.細(xì)胞對(duì)LLC肺癌細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷活性(81.02±2.18％)。兩者相比較差異有顯著性(p＜0.01)。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞為20:1時(shí)，DC-LAK細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞的殺傷活性(75.10±3.68％)仍明顯高于LAK細(xì)胞的殺傷活性(57.9

9、2±2.11％)(p＜0.01)。4外源性殺傷細(xì)胞回輸荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。 (1)外源性殺傷細(xì)胞經(jīng)腹腔注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，標(biāo)記的DC-LAK細(xì)胞于回輸后1h時(shí)，在肺臟內(nèi)的分布達(dá)到峰值；4h時(shí)，肝臟和脾臟內(nèi)的分布達(dá)到峰值；24h時(shí)，腫瘤內(nèi)的分布達(dá)到峰值，此時(shí)腫瘤內(nèi)的分布高于其他臟器(p＜0.05)。72h時(shí)，此時(shí)脾臟內(nèi)分布最多(p＜0.05)。在整個(gè)觀測(cè)過(guò)程中，外周血中的分布始終很低。與LAK細(xì)胞組相比，在1h、4h、24

10、h時(shí)腫瘤內(nèi)的分布DC-LAK組高于LAK組(p＜0.05)。在72h時(shí)腫瘤內(nèi)的分布兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (2)外源性殺傷細(xì)胞經(jīng)瘤旁皮下注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，標(biāo)記的DC-LAK細(xì)胞于回輸后1h時(shí)，在肺臟內(nèi)的分布達(dá)到峰值；4h時(shí)，肝臟內(nèi)的分布達(dá)到峰值；24h時(shí)，腫瘤脾臟內(nèi)的分布達(dá)到峰值，此時(shí)腫瘤內(nèi)的分布高于其他臟器(p＜0.05)。72h時(shí)，腫瘤脾臟內(nèi)分布最多。在整個(gè)觀測(cè)過(guò)程中，外周血中的分布始終很低。與LAK細(xì)胞組相比，在1h

11、、4h、24h時(shí)腫瘤內(nèi)的分布DC-LAK組高于LAK組(p＜0.05)。在72h時(shí)腫瘤內(nèi)的分布兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (3)兩種回輸途徑回輸?shù)谋容^。腹腔注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，DC-LAK細(xì)胞主要分布于肝臟和脾臟中；瘤旁皮下注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，DC-LAK細(xì)胞主要分布于腫瘤中。在各觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)，DC-LAK細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的分布瘤旁皮下注射組均高于腹腔注射組(p<0.05)。 結(jié)論： 1.小鼠骨髓細(xì)胞體外聯(lián)合應(yīng)

12、用rmGM-CSF和rmIL-4培養(yǎng)，經(jīng)腫瘤細(xì)胞凍融抗原致敏，可以誘導(dǎo)擴(kuò)增出較多數(shù)量、較高純度的樹(shù)突狀細(xì)胞，可滿足一般試驗(yàn)的要求。 2.腫瘤凍融抗原致敏DC誘導(dǎo)的LAK細(xì)胞對(duì)小鼠LLC細(xì)胞具有高效的特異性殺傷作用。 3.DC-LAK細(xì)胞經(jīng)腹腔注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，主要分布于肝臟和脾臟中；經(jīng)瘤旁皮下注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，主要分布于腫瘤組織中。DC與LAK細(xì)胞共培養(yǎng)后經(jīng)兩種途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，均可提高LAK細(xì)