慢性乙型肝炎不同免疫時相期NK細胞功能的研究.pdf

1、目的
　　1、研究慢性HBV感染患者不同時期NK細胞功能的變化,以及與ALT水平、病毒載量的關(guān)系。
　　2、橫向分析慢性HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者,不同血清總膽紅素水平下NK細胞功能狀態(tài)的差異,以及與ALT水平、病毒載量的關(guān)系。
　　3、比較患者在治療過程中,NK細胞頻率及功能變化。
　　方法
　　1、63例慢性HBV感染者分為(1)HBV-相關(guān)的慢加急性肝衰竭患者18例,應用核苷類似物抗病毒綜合治療,在

2、治療過程中,87次抽取外周血,根據(jù)血清總膽紅素分為3組即Tbil≥10ULN(正常上限值)(例次=59)、5ULN　　2、時間分辨熒光免疫定量技術(shù)(TRFIA)定量檢

3、測乙肝病毒標志物五項指標即乙肝表面抗原及抗體(HBsAg和HBsAb);e抗原及e抗體(HBeAg和HBeAb);核心抗體(HBcAb)。應用Realtime-PCR定量檢測HBV-DNA水平。雅培全自動生化儀檢測肝功能九項指標。
　　3、采用EZ-Sep?人淋巴細胞分離管分離出外周血淋巴細胞(PBMC)。
　　4、流式細胞術(shù)檢測NK細胞頻率、亞型、NK細胞表面受體(活化性受體/抑制性受體)表達水平,
　　5、細胞內(nèi)因

4、子染色后檢測NK細胞分泌γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α等細胞因子的水平。
　　6、細胞內(nèi)因子染色后檢測NK細胞分泌顆粒酶B、穿孔素,分析NK細胞細胞毒活性。
　　7、FlowjoSoftware對流式圖進行處理,SPSS20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,p值<0.05認為有顯著差異性。
　　結(jié)果
　　1、慢性HBV感染不同時期NK細胞頻率及功能分析
　　(1)與健康對照組相比,慢性HBV感染不同時期PBMC中NK細

5、胞頻率均顯著降低(P<0.05),NK細胞亞型CD56dim頻率均低于健康對照組(P<0.001),而NK細胞亞型CD56bright頻率均高于健康對照組(P<0.001)。各組之間比較,慢加急性肝衰竭患者NK細胞頻率低于IA組、IT組(P<0.05)。
　　(2)與健康對照組相比,IA組NK細胞活化性受體NKp46顯著升高(P<0.05),IT組表達NKp46、NKp30均也升高(P<0.05),而IA組抑制性受體NKG2A表達

6、下降(P<0.05),IT組則無明顯差異;ACLF組表達活化性受體和抑制性受體水平較健康對照均無明顯差異;各組間比較也無明顯差異。
　　(3)與健康對照相比,慢性HBV感染患者NK細胞分泌細胞因子IFN-γ均較低(P<0.001),細胞因子TNF-α與健康對照相比無明顯差別;各組間比較IFN-γ分泌量均無明顯差異,IA、IT組分泌TNF-α水平較ACLF組高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)與健康對照相比,慢性HBV感染

7、患者NK細胞分泌顆粒酶B水平均較低,其中IA組和ACLF組與健康對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),穿孔素分泌水平均高于健康對照組(P<0.01)。各組間相比顯示,IA組、IT組分泌顆粒酶B水平明顯高于ACLF組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而穿孔素各組之間比較并無明顯差異。
　　2、HBV-相關(guān)ACLF患者Tbil不同水平下NK細胞頻率及其功能變化
　　(1)與健康對照相比,慢加急性肝衰竭患者NK細胞頻率及

8、CD56dimNK細胞頻率均降低(P<0.05),而CD56brightNK細胞亞群頻率均較健康對照高(P<0.05),但不同Tbil水平之間NK細胞頻率和NK細胞亞群頻率差異均無統(tǒng)計學意義。
　　(2)與健康對照相比,ACLF患者NK細胞活化性受體NKp30表達水平升高(P<0.05),NKp46表達水平較高,但無統(tǒng)計學意義,活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A與健康對照均無明顯差異。不同Tbil水平下各組間比較活化性受體

9、與抑制性受體均無明顯差異。
　　(3)與健康對照相比,ACLF患者NK細胞分泌IFN-γ均顯著較低(P<0.001),TNF-α分泌量無明顯差別;不同Tbil水平比較IFN-γ、TNF-α均無明顯差別。
　　(4)與健康對照相比,ACLF患者NK細胞分泌顆粒酶B水平均較低(P<0.01),NK細胞分泌穿孔素水平較高(P<0.05);不同Tbil水平比較顯示第2組分泌顆粒酶B明顯高于第3組(P<0.05),而穿孔素不同Tbil

10、水平之間無統(tǒng)計學差異。
　　3、慢性HBV患者NK細胞功能與ALT水平及病毒載量的相關(guān)分析
　　慢性HBV感染者ALT水平與NK細胞分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α呈負相關(guān),而NK細胞功能與病毒載量之間無明顯相關(guān)性。ACLF患者NK細胞頻率、分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α與ALT水平均無明顯相關(guān)性;HBV相關(guān)的慢加急性肝衰竭患者NK細胞頻率與病毒載量無明顯相關(guān)性,NK細胞分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α水平與病毒載量

11、呈負相關(guān)。
　　4、HBV相關(guān)ACLF患者治療過程中NK細胞頻率及功能變化
　　在Tbil下降過程中NK細胞頻率及分泌細胞因子IFN-γ呈上升趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義;分泌細胞因子TNF-α未見明顯趨勢。NK細胞細胞毒活性中分泌穿孔素呈下降趨勢,無統(tǒng)計學差異;而顆粒酶B表現(xiàn)不明顯。
　　結(jié)論
　　1、慢性HBV感染不同時期NK細胞功能活性與健康對照相比均受到不同程度抑制,而ACLF患者受到抑制程度較CHB患者高。

12、
　　2、慢性HBV感染者NK細胞分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α均與ALT水平呈負相關(guān),NK細胞功能與病毒載量之間相關(guān)性不明顯。HBV相關(guān)ACLF患者NK細胞分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α均與HBV-DNA水平呈負相關(guān),與ALT水平無明顯相關(guān)性。
　　3、動態(tài)觀察ACLF患者,發(fā)現(xiàn)隨病情恢復NK細胞頻率及分泌因子IFN-γ有升高趨勢,而細胞毒活性呈現(xiàn)下降趨勢。
　　本課題的創(chuàng)新點
　　1、比較系統(tǒng)地研究了