抗HBV治療對(duì)慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能的影響.pdf

1、慢性乙型病毒性肝炎(chronichepatitisB，CHB)的發(fā)病機(jī)制一直是傳染病領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。迄今，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染慢性化以及其持續(xù)感染的機(jī)制尚未闡明。自20世紀(jì)90年代中期以來(lái)，慢性乙型肝炎的抗病毒治療雖然取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是現(xiàn)有的抗病毒藥物和治療方案仍然無(wú)法從大多數(shù)慢性HBV感染者體內(nèi)徹底清除乙肝病毒。毫無(wú)疑問(wèn)，闡明HBV感染慢性化及持續(xù)感染的發(fā)生機(jī)制對(duì)于最終治愈慢性乙型

2、肝炎尤為重要。雖然已零星報(bào)道應(yīng)用抗病毒治療藥物后部分慢性乙型肝炎患者的抗病毒免疫力有所提高，但是目前系統(tǒng)的研究報(bào)道甚少，且具體機(jī)制不明。本研究主要完成了以下兩方面的工作：
　　一、CHB患者外周血Tregs細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞表面PD-1和BTLA的表達(dá)和意義
　　為了觀察慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)患者外周血CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcells，Treg）的變

3、化及CD4+T細(xì)胞表面PD-1（programmedcelldeath1,CD279）和BTLA（BandTlymphocyteattenuator）的表達(dá)情況以及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。我們采用密度梯度離心法分離39例CHB患者和19例健康對(duì)照者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25highTreg細(xì)胞亞群占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例及CD4+T淋巴細(xì)胞表面的抑制性分子PD-1和BTLA的表達(dá)，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR法

4、檢測(cè)外周PBMC中BTLAmRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果①CHB組CD4+CD25highTreg占CD4+T細(xì)胞的百分比為7.38±2.02％，明顯高于正常對(duì)照組4.99±1.15％（P<0.0001）。HBVDNA定量>108copies/mL的患者CD4+CD25highTreg占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比(7.75±2.18％)，顯著高于HBVDNA定量<108copies/mL的患者(6.55±2.34％，P<0.05)

5、。
　　②CD4+PD-1+占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比：CHB患者(58.73±11.11％)與正常對(duì)照組(47.75±12.69％)比較具有明顯差異（P=0.0013）,HBVDNA定量>108copies/mL的患者中CD4+PD-1+占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比（61.18±12.02％）與HBVDNA定量小于108copies/mL的患者（54.36±7.88％）相比無(wú)明顯差異（P=0.0552），但HBVDNA定量>1

6、08copies/mL的患者中CD4+PD-1+占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比在數(shù)值上高于HBVDNA定量小于108copies/mL的患者。
　?、跜D4+BTLA+占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比：CHB患者(2.79±0.29％)與正常對(duì)照組(2.386±0.4810％)比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.085）。在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的BTLA-mRNA的表達(dá)在慢性乙型肝炎組為1.097±0.0634，而在正常對(duì)照中為1.010±0.

7、1449，兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.916）。
　?、蹸D4+CD25highPD-1+T細(xì)胞在慢性乙型肝炎患者中(97.78±5.65％)與正常對(duì)照(99.11±1.133％)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.37），CD4+CD25highBTLA+T細(xì)胞在慢性乙型肝炎患者中(9.811±6.013％)與正常對(duì)照(13.97±10.84％)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.11）。
　　⑤CHB患者CD4+CD25highTreg細(xì)胞

8、與HBVDNA載量正相關(guān)（r=0.3314，P=0.0393），CD4+T淋巴細(xì)胞表面的負(fù)性調(diào)節(jié)分子PD-1也與HBVDNA載量正相關(guān)（r=0.3712，P=0.02）。
　　結(jié)論CD4+CD25highTreg細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中的比例及CD4+T淋巴細(xì)胞表面抑制性分子PD-1的升高可能抑制CHB患者的細(xì)胞免疫反應(yīng)，影響病毒的清除，導(dǎo)致HBV感染慢性化。
　　二抗HBV治療過(guò)程CHB患者外周Treg細(xì)胞、CD4+T細(xì)

9、胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)及單核細(xì)胞表面TLR2/TLR4的表達(dá)及意義
　　在前述研究的基礎(chǔ)上，對(duì)28例接受替比夫定抗HBV治療的慢性乙型肝炎患者不同治療時(shí)間點(diǎn)外周血Tregs細(xì)胞的變化、CD4+細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)和單核細(xì)胞表面TLR2/TLR4的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)和分析，以期探討抗病毒治療對(duì)慢性乙型肝炎患者免疫功能的影響。采用密度梯度離心法分離28例患者在基線、治療后3個(gè)月和6個(gè)月的外周血獲取PBMC，使用流式

10、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期外周Treg細(xì)胞的頻率、CD4+T表面PD-1和PD-L1的表達(dá),單核細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)；ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-9的濃度。T
　　結(jié)果①CHB患者抗病毒治療過(guò)程中，在基線、治療3月和6月HBVDN值取對(duì)數(shù)后的的結(jié)果分別為：7.672±0.3055、3.688±0.2711和2.628±0.3176，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，P<0.001)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移

11、酶結(jié)果分別為：111.7±9.206u/L、68.19±12.38u/L和30.38±3.273u/L，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，P<0.001)。
　?、贑HB患者外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞在基線（10.48±0.4809％）和治療后3個(gè)月（7.290±0.4258％）、治療后6個(gè)月（7.078±0.4274％）比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001，P<0.0001），治療3個(gè)月和6個(gè)月間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、差異；在基線、3個(gè)月和6個(gè)月CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比分別為：27.95±1.553％、24.03±1.497％、25.69±1.437％，CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群的比例在基線和治療后3個(gè)月兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0238），其余比較無(wú)差異。
　　③在基線、治療后3個(gè)月和治療后6個(gè)月的CD4+PD-1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比分別為：42.52±3.386％、33.19±3.352％和4

13、0.08±3.931％，分析發(fā)現(xiàn)治療后3個(gè)月較基線明顯減低（P=0.0118），余組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CD4+PD-L1+T細(xì)胞亞群的百分比在基線、治療后3個(gè)月和6個(gè)月分別為：0.9258±0.2213％、0.4827±0.0909％、0.5258±0.0913％，各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0747、P=0.0631），但治療后較基線在數(shù)值上較低較明顯。
　　④CHB患者在基線、治療后3個(gè)月和6個(gè)月TLR2的平均免疫熒光強(qiáng)度（

14、meanfluorescenceintensity，MFI）分別為：89.07±6.089、96.12±8.803和102.9±6.633，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)治療后6個(gè)月較基線明顯增加（P=0.0399），余組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；TLR4的MFI分別為：41.17±2.397、38.20±2.125、40.48±2.371，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)各組間無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　　⑤經(jīng)檢測(cè)20例CHB患者血清中的IFN-γ在基線、治療

15、3個(gè)月和6個(gè)月的血漿濃度分別為：24.49±3.862pg/ml、21.86±2.873pg/ml、27.28±6.581pg/ml，各組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但治療后6個(gè)月血中IFN-γ的濃度值較基線和3個(gè)月升高；血漿中的IL-9濃度分別為：30.89±5.279pg/ml、25.80±4.159pg/ml、12.76±2.524pg/ml，治療后3個(gè)月、6個(gè)月較基線明顯下降（P=0.010、P=0.0086）。