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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:原核表達(dá)EB病毒(Epstein.Barr virus,EBV)衣殼蛋白p23-p18融合蛋白,研制EBV特異性衣殼抗原(viralcapsid antigen,VCA)抗體ELISA檢測(cè)試劑。 方法: 1.選擇p23編碼基因BLRF2(氨基酸1~162)和p18編碼基因BFRF3的C端(氨基酸105~176)基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8為模板,采用重疊延伸PCR技術(shù),將兩段基因通過(guò)多肽接頭(
2、Gly4Ser)3 DNA序列連接以獲得融合基因p23-p18。 2.融合基因經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列準(zhǔn)確無(wú)誤后,導(dǎo)入表達(dá)載體pThioHis A構(gòu)建原核表達(dá)克隆,轉(zhuǎn)染E.coli BL21后IPTG誘導(dǎo)表達(dá),重組蛋白經(jīng)鎳-敖合物瓊脂糖樹(shù)脂柱親和層析純化獲得融合抗原,Western blot鑒定其特異性。 3.用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清滴定抗原效價(jià),選擇最適濃度包被ELISA反應(yīng)板,配套商品化的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)羊抗人IgM、IgG及其它一系列試
3、劑,反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)條件,組裝成EBV特異性VCA IgM和IgG間接ELISA診斷試劑。 4.選擇血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并與“金”標(biāo)準(zhǔn)即間接免疫熒光(IFA)和NOVATEC公司生產(chǎn)的VCA IgM和IgG ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較,計(jì)算該試劑的敏感性、特異性、約登指數(shù)、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo),同時(shí)檢測(cè)診斷試劑的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 結(jié)果:p23和p18融合基因成功構(gòu)建并有效表達(dá),Western blot顯示融合
4、抗原具有較高的特異性和敏感性。與IFA比較,采用融合衣殼抗原制備的EBV VCAIgG診斷試劑盒的敏感性、特異性、約登指數(shù)、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為97.3%、97.4%、0.947、97.3%、99.8%和77.6%;IgM ELISA診斷試劑盒的上述各項(xiàng)指標(biāo)分別為94.8%、99.5%、0.943、98.7%、97.3%和98.9%。融合抗原ELISA與NOVATEC公司同類產(chǎn)品有較高的符合率(IgG為97.7%,IgM
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