eb病毒檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用ppt課件

1、EB病毒檢測(cè)技術(shù)及臨床應(yīng)用,1,概述,Epstein-Barr病毒（EBV）皰疹病毒科，γ亞科，嗜淋巴細(xì)胞病毒屬，1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲兒童的惡性淋巴瘤組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)。EBV是是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，也是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒，與鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖癥等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，被列為致癌性病毒之一。,2,概述,傳播途徑：EBV感染主要通過(guò)唾液接觸傳播，也可通過(guò)血液傳播；人感染E

2、BV后建立終身潛伏感染，人群感染率超過(guò)90%。1-6歲兒童、14-20歲青少年及年輕成年人高度易感，發(fā)展中國(guó)家EBV感染多發(fā)生在兒童早期。,3,病原學(xué),皰疹病毒科，γ皰疹病毒亞科，淋巴隱病毒屬，人皰疹病毒4型球形雙鏈DNA病毒，基因組平均大小約為172 kb,4,,5,,6,EBV致病機(jī)制,原發(fā)EBV感染時(shí)，EBV先是在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，然后感染附近的B淋巴細(xì)胞，受到感染的B淋巴細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)可以造成全身性感染。EBV原

3、發(fā)感染后，大多數(shù)無(wú)臨床癥狀，尤其是6歲以下幼兒大多表現(xiàn)為隱性或輕型發(fā)病，但在兒童期、青春期和青年期 ，約50%的原發(fā)性感染均表現(xiàn)為IM。,7,EBV致病機(jī)制,EBV在人體B細(xì)胞建立潛伏感染，EBV只表達(dá)潛伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者將成為終身帶毒者。在機(jī)體免疫功能下降和某些因素觸發(fā)下，潛伏的EBV可以被再激活，引起

4、病毒復(fù)制及臨床疾病。,8,EBV常見(jiàn)相關(guān)疾病,傳染性單核細(xì)胞增多癥 （Infectious mononucleosis,IM)慢性活動(dòng)性EB病毒感染 （Chronic active EBVinfection，CAEBV）EB病毒相關(guān)性嗜血細(xì)胞綜合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS)Burkitts淋巴瘤 何奇金淋巴瘤,9,EBV感染的抗原表達(dá),EBV

5、溶解性感染期，可表達(dá)：早期抗原（EA）：EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）； EA出現(xiàn)表明EBV活躍增殖，EA抗體出現(xiàn)在感染早期；衣殼蛋白（VCA）晚期表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白VCA-IgM出現(xiàn)在急性感染早期，VCA-IgG出現(xiàn)在急性感染期并持續(xù)存在膜抗原（MA）：細(xì)胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原抗MA-IgM可用于早期診斷,10,EBV潛伏感染期，選擇性表達(dá)早期抗原以及：

6、 核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：為DNA結(jié)合蛋白，在感染的B細(xì)胞核內(nèi)；EBNA-1與感染有關(guān)，EBNA-2與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化有關(guān)；EBNA抗體出現(xiàn)在感染晚期。 潛伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）：在感染B細(xì)胞表面，與細(xì)胞惡化有關(guān)， 未翻譯的轉(zhuǎn)錄物BARF0和EBER EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTL CD8+的主要目標(biāo),EBV感染的抗原表達(dá),11,原發(fā)性EBV感染

7、過(guò)程中首先產(chǎn)生針對(duì)衣殼抗原（capsid antigen, VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（early antigen, EA）抗體出現(xiàn)在恢復(fù)期晚期，抗核抗原（nuclear antigen, NA）抗體產(chǎn)生，抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持續(xù)終身,12,EBV感染的血清學(xué)診斷,,13,傳統(tǒng)檢測(cè)策略的問(wèn)題,,14,EBV感染的血清學(xué)診斷,抗VCA-IgM和IgG可以同時(shí)出現(xiàn)，通常IgG出現(xiàn)較IgM晚，但偶爾較

8、IgM出現(xiàn)早1~2周，抗VCA-IgM幾周后檢測(cè)不到抗EA-IgG在發(fā)病后3-4周后升高，3~4月后檢測(cè)不到抗EBNA-1-IgG在發(fā)病后3~4周被檢測(cè)到，持續(xù)終身，部分慢性EBV感染者檢測(cè)不到抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG終生持續(xù)陽(yáng)性,15,EBV常見(jiàn)相關(guān)疾病,16,傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)infectious mononucleosis,特指由EBV感染引起的發(fā)熱、咽炎和淋巴結(jié)腫大的綜合征1889年被首次描述

9、為“glandular fever”1920年正式定義為IM1932年發(fā)現(xiàn)嗜異性凝集實(shí)驗(yàn)1968年實(shí)驗(yàn)室工作人員感染EBV，出現(xiàn)IM臨床癥狀和嗜異性凝集抗體，明確EBV是IM的病原,17,IM臨床表現(xiàn),25-30%的青少年和<30歲的成年人原發(fā)感染EBV后表現(xiàn)IM兒童時(shí)期EBV感染多為亞臨床型或不典型癥狀臨床癥狀：發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、扁桃體炎（灰白色滲出）、咽炎、肝脾腫大、眼瞼水腫和皮疹、上腭粘膜出血點(diǎn)皮疹經(jīng)常發(fā)生于使用

10、氨芐西林、阿莫西林和一些β內(nèi)酰胺類抗生素1周后，發(fā)生率90%并發(fā)癥：粒細(xì)胞減少、血小板減少、脾破裂、扁桃體肥大致氣道阻塞、暴發(fā)性肝炎、溶血性貧血、再生障礙性貧血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,18,19,慢性活動(dòng)性EBV感染, CAEBV chronic active EBV infection,1975年Horwitz首次描述一些持續(xù)性IM患者血清存在高滴度的抗EBV-VCA和EA抗體1982年Tobi進(jìn)一步描述并證實(shí)該病1984年被稱為

11、慢性單核細(xì)胞增多樣綜合征1986年被定義為慢性癥狀性EBV感染1991年被稱為慢性活動(dòng)性EBV感染,20,CAEBV,發(fā)生于兒童或年輕成年人該病表現(xiàn)為慢性或反復(fù)的單核細(xì)胞增多樣癥：發(fā)熱、肝脾腫大、持續(xù)性肝炎、廣泛性淋巴結(jié)腫大EBV感染的NK和T細(xì)胞克隆擴(kuò)增在CAEBV具有重要意義通常是一種腫瘤前狀態(tài)或者與嚴(yán)重免疫缺陷有關(guān)，可進(jìn)一步引起EBV相關(guān)的T/NK細(xì)胞增殖性疾病預(yù)后差，病死率高,21,CAEBV的診斷標(biāo)準(zhǔn),1）持續(xù)性或

12、反復(fù)發(fā)作的IM樣癥狀2）異常升高的抗VCA-IgG和EA-IgG和/或受累組織包括外周血檢測(cè)到EBV基因組3）慢性疾病不能以其他已知的疾病解釋,Okana M, et al. Proposed guidelines for diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection. America J Hematol.2005,80:64-69,22,Hydroavaccin

13、iforme牛痘樣水皰,hypersensitivity to mosquito bites,23,CAEBV的診斷標(biāo)準(zhǔn)(1),臨床癥狀持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的IM樣癥狀發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大并發(fā)癥：血液系統(tǒng)（EBV-HLH、淋巴瘤、白血病、DIC、血小板減少、貧血）消化系統(tǒng)（肝功能衰竭、消化道潰瘍）中樞神經(jīng)系統(tǒng)間質(zhì)性肺炎心血管（冠狀動(dòng)脈瘤、心肌炎、心瓣膜病）皮膚（蚊蟲(chóng)叮咬過(guò)敏、皮膚牛痘樣水皰 ）,24,CAEBV的

14、診斷標(biāo)準(zhǔn)(2),血清抗體滴度異常升高抗VCA-IgG≥1:640和抗EA-IgG≥1:160抗VCA-IgA和/或抗EA-IgA常呈陽(yáng)性受累組織和外周血檢測(cè)到EBV-DNA、RNA、有關(guān)抗原和克隆PCR：外周血PBMC中EBV-DNA定量>102.5copies/µg 原位雜交：檢測(cè)出EBER-1陽(yáng)性細(xì)胞Southern雜交：受累組織或外周血中檢測(cè)出EBV DNA免疫熒光：檢測(cè)到抗原（EBNA、LMP）感

15、染的B、T、NK細(xì)胞、單核/巨噬/組織細(xì)胞檢測(cè)到EBNA、EBER、EBV-DNA,25,EBV相關(guān)的噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH,是一種與EBV感染有關(guān)的淋巴增殖伴隨吞噬血細(xì)胞現(xiàn)象的一類疾病EBV感染所致CD8+T細(xì)胞的異常增殖及其激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子大量釋放產(chǎn)生高細(xì)胞因子血癥（細(xì)胞因子風(fēng)暴）是EBV-HL

16、H的主要病例生理特征臨床表現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大、黃疸、全血細(xì)胞減少、DIC，骨髓和其他組織見(jiàn)嗜血細(xì)胞、LDH、鐵蛋白、β微球蛋白EBV-HLH常見(jiàn)于兒童和青少年,26,抗EBV病毒藥物,無(wú)環(huán)核苷擬似劑acyclovir（阿昔洛韋），ED50 0.3µΜganciclovir（更昔洛韋）， ED50 0.05µΜvalaciclovir（纈昔洛韋 ）無(wú)環(huán)核苷酸cidofovir，adefovir焦磷酸鹽 擬

17、似劑 foscarnet（磷甲酸鈉）作用機(jī)制作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒復(fù)制,27,EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,外周血分類淋巴細(xì)胞≥50% WBC不典型淋巴細(xì)胞≥10% WBC（系激活的CD8+ CTL）血清學(xué)檢查嗜異性凝集實(shí)驗(yàn)（heterophile test/spot test）VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG病毒學(xué)標(biāo)志在PBMC、血清、全血或感染組織檢測(cè)EBV-DNA、EBER、EBNA、L

18、MP,28,EBV感染疾病的血清學(xué)診斷,,29,臨床需要回答的問(wèn)題,是否感染EBV?EBV感染的時(shí)相？是否EBV活動(dòng)性感染？疾病是否與EBV感染相關(guān)？,30,EBV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,病毒培養(yǎng)免疫學(xué)技術(shù)（免疫熒光法，免疫組化技術(shù)） 血清學(xué)方法（ELISA法，化學(xué)發(fā)光法） 基因診斷技術(shù),31,EBV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,嗜異凝集抗體試驗(yàn)：也稱“Monospot”試驗(yàn)。在EBV還未確定為IM的病因之前，1932年引入臨床實(shí)踐診斷IM。當(dāng)

19、時(shí)發(fā)現(xiàn)IM患者的血清或血漿可以凝集馬或綿羊的紅細(xì)胞。該抗體在病程第1～2周出現(xiàn)，持續(xù)約6個(gè)月。在青少年原發(fā)性EBV感染中其陽(yáng)性率可達(dá)80％-90％，約10％的青少年缺乏對(duì)嗜異性抗體的陽(yáng)性反應(yīng)。,32,EBV感染的血清學(xué)診斷評(píng)價(jià),嗜異性抗體（heterophile antibody，HA）凝集實(shí)驗(yàn)（“spot” test）嗜異性抗體（IgM）在發(fā)病后7天內(nèi)出現(xiàn)，2-5周達(dá)高峰，可以持續(xù)6-12個(gè)月，偶有12個(gè)月后以低水平存在HA陽(yáng)性

20、提示原發(fā)急性感染，EBV再激活感染幾乎陰性陽(yáng)性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5歲兒童50%假陰性：發(fā)病第1周內(nèi)假陰性率25%，10%成人始終陰性假陽(yáng)性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心內(nèi)膜炎、HAV肝炎,33,缺點(diǎn)需要硬件設(shè)備成本昂貴,優(yōu)點(diǎn)敏感性高特異性強(qiáng)操作簡(jiǎn)便,化學(xué)發(fā)光技術(shù),34,膠體金是氯金酸HAuCl4的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),

21、簡(jiǎn)便，快捷，敏感度和特異度較差,35,EBERS原位雜交試驗(yàn) EBV潛伏感染的細(xì)胞含有大量的EBERl／EBER2（EBERS）轉(zhuǎn)錄子，其主要功能是抑制干擾素介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)和凋亡。該轉(zhuǎn)錄子不翻譯成蛋白質(zhì)，每個(gè)EBV潛伏感染的細(xì)胞含有大約106拷貝EBERS，被認(rèn)為EBV潛伏感染的最好標(biāo)志物，因此原位雜交檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中EBERS是診斷腫瘤是否EBV相關(guān)的金標(biāo)準(zhǔn),EBV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,36,EBV病毒核酸檢測(cè),實(shí)時(shí)熒光定

22、量PCR是目前最主要的監(jiān)測(cè)EBV載量的方法鑒別EBV健康攜帶者的低水平復(fù)制與EBV相關(guān)疾病患者高水平活動(dòng)性感染。,37,EBV載量檢測(cè)有多種方法，Real-time PCR是目前最主要的監(jiān)測(cè)EBV載量的方法，有較強(qiáng)的敏感性和特異性。不同的EBV疾病進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)時(shí)，需要的標(biāo)本不同。,EBV病毒核酸檢測(cè),38,EBV相關(guān)性疾病的病毒DNA定量檢測(cè),血清游離的EBV-DNA提示原發(fā)感染或者再激活健康攜帶者血清EBV

23、-DNA通常檢測(cè)不到,39,40,41,42,傳單的EBV感染實(shí)驗(yàn)室診斷,血清學(xué)檢測(cè)：同時(shí)滿足下列2條者可以診斷為EBV-IM:1.下列臨床癥狀中的3項(xiàng)：發(fā)熱、咽峽炎、頸淋巴結(jié)腫大、肝腫大、脾腫大；2.原發(fā)性EBV感染的血清學(xué)證據(jù)，滿足下列2條中任一項(xiàng)： （1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG陽(yáng)性，且抗EBV-NA-IgG陰性（2）抗EBV-CA-IgM陰性，但抗EBV-CA-IgG陽(yáng)性，且為低親和力抗體,43,

24、傳單的EBV感染實(shí)驗(yàn)室診斷,DNA檢測(cè)？:IM患者外周血中EB病毒載體在2周內(nèi)達(dá)到峰值，隨后很快下降。至病程14天，多數(shù)EBV-IM患者血清中已檢測(cè)不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均檢測(cè)不到病毒核酸。IM患者不推薦進(jìn)行EB病毒載量檢測(cè),44,慢性活動(dòng)性EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,EBV抗體檢測(cè),45,慢性活動(dòng)性EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,DNA檢測(cè)絕大多數(shù)CAEBV患者PBMC中EBV-DNA水平高于102.5拷貝

25、/ug DNA部分CAEBV患者血漿/血清中EBV-DNA陰性CAEBV患者血漿/血清中EBV-DNA水平與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān),46,EB病毒相關(guān)噬血淋巴組織細(xì)胞增生癥,EBV-HLH可以發(fā)生在原發(fā)性EBV感染時(shí)期，既往EBV感染再激活時(shí)期EBV-HLH患者血清中EBV抗體反應(yīng)呈多種反應(yīng)類型，單純血清EBV抗體檢測(cè)對(duì)EBV-HLH的診斷意義不大。,47,EB病毒相關(guān)噬血淋巴組織細(xì)胞增生癥,DNA檢測(cè):EBV-HLH患者外周

26、血單個(gè)核細(xì)胞和血漿/血清均含有很高的EBV-DNA載量，結(jié)合血清學(xué)抗體檢測(cè)，有助于EBV-HLH的診斷。監(jiān)測(cè)EBV-HLH患者血清中EBV-DNA載量有助于評(píng)估治療效果。,48,小 結(jié),EB病毒感染率高,傳播范圍廣,且多為隱性感染,臨床癥狀多種多樣,臨床診斷和治療較為復(fù)雜，EB病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在臨床診斷中具有重要意義，根據(jù)臨床需要進(jìn)行合理分析，選擇方便、實(shí)用、高效的檢測(cè)方法，為臨床治療提供依據(jù)。,49,Thank you,謝 謝