Zonulin在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用研究與甘氨鵝脫氧膽酸細胞毒性的體外實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　本論文包括兩個部分的內容。
　　第一部分:zonulin在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用研究
　　動脈粥樣硬化的形成機制一直是心血管疾病研究的焦點之一。除了內皮損傷學說,泡沫細胞形成機制與平滑肌細胞增生理論等經典觀點以外,越來越多的證據顯示機體持續(xù)慢性系統炎癥狀態(tài)與動脈粥樣硬化的形成密切相關,最近針對腸道菌群與冠心病發(fā)病之間聯系的報道也為粥樣硬化的形成機制提供了新的觀點。腸道菌群通過何種機制參與動脈粥樣硬

2、化形成,其促進動脈粥樣硬化形成依賴于何種條件,以及在與此相關的發(fā)病機制中是否存在可供干預的靶點成為最近粥樣硬化機制研究的熱點問題。
　　研究報道在粥樣硬化斑塊中檢測到細菌DNA,其中部分為腸源性細菌產物。針對慢性牙周炎患者患冠心病的機制研究也提示反復菌血癥能顯著增加冠心病發(fā)病率。如能明確細菌是否參與無明顯反復感染患者的動脈粥樣硬化發(fā)病機制,并進一步了解細菌如何進入人體并參與動脈動脈粥樣硬化發(fā)病機制,可為粥樣硬化形成機制的細菌學說提

3、供更多的證據。在此基礎上尋找可干預細菌進入人體的關鍵環(huán)節(jié),試通過對關鍵靶點進行干預減少細菌進入人體的機會,將為預防和治療動脈粥樣硬化提供新的思路。
　　Zonulin是腸道上皮細胞合成的一種功能蛋白,能夠通過調節(jié)腸上皮細胞間緊密連接蛋白的結構而改變腸上皮間隙的通透性。研究發(fā)現克隆病患者中存在腸道zonulin水平升高與患冠心病幾率增加的并存現象,如果zonulin水平升高可增加患冠心病的機會,那么zonulin很可能通過調節(jié)腸道上

4、皮屏障的通透性而增加細菌進入人體的機會。為此,本研究用WesternBlot方法研究動脈粥樣硬化患者血清中Zonulin的表達水平改變,用基于細菌16srDNA的高通量測序方法尋找無反復感染動脈粥樣硬化患者血液中的細菌DNA產物,并試圖在體外建立的腸上皮細胞屏障模型中研究部分細菌通過腸上皮屏障的機制。通過上述研究尋找腸道細菌與動脈粥樣硬化形成的具體聯系機制,以期為動脈粥樣硬化的診治提供新的思路。
　　第二部分:甘氨鵝脫氧膽酸細胞毒

5、性的體外實驗研究
　　妊娠肝內膽汁淤積綜合征(intrahepaticcholestasisofpregnancyICP)是一組妊娠合并癥,發(fā)病率因地而異,在長江流域地區(qū)可高達4-6％,是該地區(qū)危害母嬰健康的重要妊娠期疾病。膽酸對于母親與胎兒的損傷成為ICP母嬰損害的主要原因。機體內生理濃度范圍內的膽酸對細胞及組織并無毒性作用,但是膽酸升高到一定濃度時,可以產生明顯的細胞毒性。膽酸對于細胞的損傷主要以誘導細胞死亡為主,其中最常見的

6、是細胞凋亡。近期研究發(fā)現膽酸還可以誘導細胞發(fā)生壞死,甚至可能是最近才報道的程序性壞死。研究膽酸對于循環(huán)及呼吸系統主要功能細胞的細胞毒性,有助于從細胞水平闡明膽酸對于循環(huán)及呼吸系統的功能損害及其分子機制,為揭示ICP相關的子代心肺損傷提供理論基礎。
　　ICP患者子代并發(fā)癥中,以早產、胎兒宮內窘迫以及新生兒肺損傷最為常見,危害也最大。早產是一系列新生兒并發(fā)癥的重要原因,胎兒宮內窘迫則是造成子代神經功能損傷的主要原因之一。膽酸對于胎兒

7、血管結構及功能的影響可能是ICP相關早產與宮內窘迫的發(fā)病機制。在胎兒血管結構中,與母兒循環(huán)中膽酸最直接接觸的是血管內皮細胞。而膽酸對于人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)是否具有損傷作用目前尚未見報道。膽酸誘導的肺泡上皮細胞損傷主要與ICP相關的新生兒肺損傷有關:當母親患有ICP時,孕婦血中膽酸水平明顯增高,羊水及胎兒血中膽酸亦相應升高,膽酸長時間浸潤并損傷肺組織,是ICP致新生兒肺損傷的關鍵因素?；贏ECⅡ在肺部的重要作用,研究膽酸對AE

8、CⅡ的細胞毒性作用將可能為ICP新生兒肺損傷作出解釋。
　　甘氨鵝脫氧膽酸(Glycochenodeoxycholate,GCDC)是膽酸的一種類型,被發(fā)現有強烈的誘導細胞死亡作用,可誘導肝細胞等一系列細胞死亡。但目前尚未見GCDC誘導HUVEC與AECⅡ死亡的報道。
　　研究目的:
　　1.檢測動脈粥樣硬化患者血清Zonulin的表達水平改變。
　　2.在動脈粥樣硬化患者循環(huán)中尋找腸道細菌DNA產物并鑒定。

9、r>　　3.建立腸上皮細胞屏障體外模型并以此為基礎研究細菌通過腸上皮屏障的機制。4.明確GCDC能否誘導HUVEC與AECⅡ細胞死亡,及其誘導死亡的具體機制。5.研究GCDC對HUVEC與AECⅡ結構與功能的影響。
　　材料方法:
　　1.采用WesternBlot方法檢測動脈粥樣硬化患者血清中的Zonulin表達變化。
　　2.用基于ROCHE454平臺的細菌16srDNA的高通量測序方法尋找無反復感染動脈粥樣硬化患

10、者血液中的細菌DNA產物。
　　3.以Caco-2細胞培養(yǎng)結合Transwell方法建立腸上皮細胞屏障體外模型,用電鏡及激光共聚焦等方法觀察細菌通過該屏障的具體機制。
　　4.采用DAPI染色,流式細胞學annexinV/PI染色分析,活性caspase3酶免疫熒光染色等方法檢測GCDC誘導HUVEC與AECⅡ細胞凋亡與壞死情況。
　　5.用Real-timePCR等法觀察GCDC對HUVEC與AECⅡ結構與功能的影響

11、。
　　結果:
　　1.動脈粥樣硬化患者血清中存在Zonulin,且其表達水平顯著高于對照組。Westernblot結果顯示:zonulin為分子量約47KD的蛋白分子,血清中檢測到與陽性對照腸上皮細胞中位置相同的條帶,且分子量符合zonulin特征。動脈粥樣硬化患者與正常對照相比較,血清zonulin的表達增高(n=8,P<0.05)。
　　2.無感染表現的動脈粥樣硬化患者血液中檢測到細菌16srDNA產物。高通量測

12、序結果顯示多種腸道來源的細菌16srDNA在無感染表現的動脈粥樣硬化患者血液中檢測出,其中以拉恩氏菌屬、沙雷氏菌屬與熒光假單胞菌屬含量最高。
　　3.體外成功建立了腸上皮細胞屏障模型,微小腸道細菌可能主要從細胞間隙通過腸道上皮屏障。Caco-2細胞經培養(yǎng)21d后分化成熟,細胞間緊密連接形成,跨上皮細胞電阻值顯著升高,形成細胞屏障。粘質沙雷氏菌可在不損害細胞的條件下通過腸上皮細胞屏障。
　　4.采用細胞原代培養(yǎng)方法,體外成功培

13、養(yǎng)出HUVEC與新生大鼠AECⅡ細胞。并對所培養(yǎng)細胞進行了特異性鑒定。GCDC在體外能夠誘導原代培養(yǎng)的新生鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞(AECII)死亡,包括凋亡和壞死。GCDC誘導的AECII死亡具有濃度依賴性,線粒體形態(tài)與功能變化參與細胞死亡過程。
　　5.GCDC處理的HUVEC出現ET-1的水平變化,3d內以降低ET-1為主,長時間處理后ET-1的變化反而升高。GCDC可有效抑制中AECⅡ肺表面活性物質的分泌。GCDC處理后的AEC

14、Ⅱ出現肺表面活性物質含量的降低。
　　結論:
　　1.腸道部分微小體積菌群可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制,其可能經腸上皮細胞間隙通過腸上皮細胞屏障。
　　2.Zonulin在動脈粥樣硬化患者血清中表達升高,可能與其具有調節(jié)腸上皮細胞間緊密連接通透性功能有關。
　　3.ICP相關新生兒肺損傷的發(fā)病機制包括GCDC誘導AECⅡ發(fā)生凋亡與壞死,以及GCDC抑制AECⅡ肺表面活性物質分泌。
　　4.ICP相關的早產