高效液相色譜法檢測(cè)兔血漿和腦脊液中的美羅培南濃度.pdf

1、目的：
　　 探討實(shí)驗(yàn)性家兔蛛網(wǎng)膜下腔出血早期血腦屏障開(kāi)放時(shí)與靜脈注射美羅培南腦脊液中的濃度變化的關(guān)系。
　　 材料和方法：
　　 一、材料
　　 1、藥品試劑、設(shè)備
　　 美羅培南(商品名:美平):日本住友株式會(huì)社生產(chǎn),批號(hào)為2003c,規(guī)格為0.5g。
　　 美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品:規(guī)格100mg,CAS NO96036-03-2,(純度98％,北京偶合科技有限公司)
　　 一次性使用

2、正壓無(wú)針連接式留置針(蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2001-0202號(hào))
　　 骨蠟(上海三友醫(yī)療器械有限公司,標(biāo)準(zhǔn)號(hào):YZB/國(guó)0236-2003)
　　 高速磨鉆STRONG204,(韓國(guó)SUESHIN公司)
　　 -80℃深低溫冰箱(日本東芝公司)
　　 GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))
　　 電子分析天平XP204(蘇州博泰偉業(yè)電子科技公司)
　　 5％碘伏,10％水合氯醛

3、,75％酒精溶液;
　　 手術(shù)刀、組織剪刀、血管鉗、顱骨磨鉆等手術(shù)器械、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)
　　 德國(guó)AGLLENT1100系列色譜工作站,1200系列恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器(安捷倫科技有限公司)
　　 色譜柱:Zorbax XDB C8柱(4.6mm×150mm×5μm)
　　 甲醇為色譜純,乙腈、三氯醋酸、磷酸二氫鈉為分析純
　　 流動(dòng)相為甲醇-水(65:35),流速為0.8ml/min,波長(zhǎng)298nm處檢測(cè)

4、,柱溫為室溫,進(jìn)樣量20ul。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 家兔30只(中華本兔),雌性、雄性各15只,體重1.80±20％kg,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　 二、方法
　　 1、留置蛛網(wǎng)膜下腔為引流管
　　 家兔用10％的水合氯醛腹腔麻醉。施麻成功后,將家兔俯臥位固定在動(dòng)物固定架上,剪刀剪除額部及頂部兔毛,5％碘伏棉球消毒局部皮膚。在家兔雙眼外眥連線(xiàn)與中線(xiàn)相交處左側(cè)約5mm開(kāi)一直

5、徑D≈8mm的圓形骨窗,用針頭在硬膜上劃出一小口。留置套管針,針頭方向面對(duì)枕后正中,與腦表面平行緩慢放入蛛網(wǎng)膜下腔。直至少量腦脊液流入纖細(xì)的引流管中。置管成功后,關(guān)閉引流管上的閥門(mén)。用醫(yī)用骨蠟封閉骨窗,縫合家兔皮膚,并將套管針外端以絲線(xiàn)縫于顱頂皮膚外固定。
　　 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 30只家兔死亡4只,其中自發(fā)死亡1只,麻醉意外死亡3只,存活26只。
　　 3、建立蛛網(wǎng)膜下腔出血家兔模型:
　　 動(dòng)物分組

6、:將26只留置引流管后存活的26只家兔隨機(jī)分組,一組為模型組,一組為對(duì)照組。其中模型組16只,對(duì)照組10只。
　　 SAH模型制作過(guò)程:
　　 采用蛛網(wǎng)膜下腔二次注入自體血的方法建立模型
　　 模型組家兔以水合氯醛施行腹腔麻醉后俯臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。找到一側(cè)耳中央動(dòng)脈,以采血針采集動(dòng)脈血,打開(kāi)家兔顱頂外置引流管閥門(mén),管口常規(guī)消毒,放出腦脊液,控制其流出量約0.4ml/kg,暫閉閥門(mén)。抽取抗凝管內(nèi)的動(dòng)脈血,按照0.

7、8ml/kg緩慢注入其蛛網(wǎng)膜下腔,采取頭低位,維持30分鐘。48小時(shí)后重復(fù)注血操作,直接注入量為0.4ml/Kg。
　　 4、操作結(jié)果
　　 第一次注血后48小時(shí)內(nèi),家兔因急性腦血管痙攣死亡2只,剩余14只;二次注血建模后,模型組再次死亡6只,殘存8只;對(duì)照組死亡1只,剩余9只。
　　 三、待測(cè)藥物的應(yīng)用
　　 1、給藥劑量的計(jì)算
　　 以標(biāo)準(zhǔn)體重人體常用量為標(biāo)準(zhǔn),換算得到實(shí)驗(yàn)兔用量。體重到標(biāo)準(zhǔn)體

8、重:Db=Da×Rab。Da,Db代表已知標(biāo)準(zhǔn)人體和欲求家兔的公斤體重劑量mg×kg-1。Rab為換算系數(shù),其中Rab參考值為0.324,標(biāo)準(zhǔn)人體體重為60kg,標(biāo)準(zhǔn)家兔體重1.8kg,標(biāo)準(zhǔn)體重在±20％范圍內(nèi)適用。Db/Da=Rab,實(shí)驗(yàn)中購(gòu)得家兔體重在1.8±20％kg,所以家兔藥物用量數(shù)值上等于Rab值,即0.324。
　　 2、給藥途徑
　　 將秤取的美平混于20ml生理鹽水中,消毒家兔耳緣靜脈局部后,通過(guò)耳緣靜

9、脈進(jìn)行注射。模型組與對(duì)照組劑量應(yīng)用參照同一標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3、標(biāo)本的采集
　　 以注射美平結(jié)束時(shí)記錄時(shí)間為0點(diǎn),于30min、1h、2h、4h、5h時(shí)間點(diǎn)取家兔耳中央動(dòng)脈血液及腦脊液。其中血液1.0ml,腦脊液＞0.2ml,分別存放在肝素抗凝管及無(wú)菌樣本瓶中。
　　 血液的采集:以10％水合氯醛6ml/kg施行腹腔麻醉后,俯臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。找到一側(cè)耳中央動(dòng)脈,采血點(diǎn)局部以5％碘伏液消毒,以采血針采集動(dòng)脈血存入無(wú)

10、菌肝素抗凝管內(nèi)。
　　 腦脊液的采集:消毒留置的外引流管閥門(mén),流出的腦脊液以無(wú)菌瓶盛裝,每次采集后暫閉三通閥門(mén)。
　　 4、樣本的后期處理
　　 將采集的標(biāo)本放入離心機(jī),配平后以10000R/min進(jìn)行離心,持續(xù)5min。離心后取得上清液,存放于-80℃冰箱內(nèi)保存,于1個(gè)月內(nèi)完成對(duì)其檢測(cè)。
　　 四、液相色譜分析法(HPLC)測(cè)定樣本濃度
　　 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備
　　 精密稱(chēng)量美羅培南標(biāo)

11、準(zhǔn)品20.000mg,置于10ml容量瓶中,加蒸餾水溶解、搖勻,得到濃度為2g/L的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)溶液。倍比稀釋后配置出濃度為2000、1000、500、200、100、50、20、10、5、2.5和1mg/L的系列儲(chǔ)備液。取空白血清和腦脊液,加入美羅培南標(biāo)準(zhǔn)液,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),血清中美羅培南的濃度測(cè)定線(xiàn)性范圍0.5-200mg/L,相關(guān)系數(shù)R為0.9997;腦脊液中美羅培南濃度測(cè)定的線(xiàn)性范圍為0.1-100mg/L,R為0.9996。

12、r>　　 2、樣品的處理和測(cè)定
　　 血清和腦脊液樣品的處理方法相同,分別精密吸取0.5ml、0.2ml樣品于試管中,離心后取上清液20μl進(jìn)樣,以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算美羅培南濃度。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血清和腦脊液美羅培南濃度,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。通過(guò)計(jì)算腦脊液與血液的比值比,比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在給藥后相同的時(shí)間點(diǎn)上美羅培南的腦脊液穿透率的差異。
　　 結(jié)果：
　　

13、血清的峰值時(shí)間在30分鐘,腦脊液的峰值時(shí)間在4小時(shí),并在在第4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上達(dá)到腦脊液的最大穿透率。其中對(duì)照組腦脊液最大穿透率11.91％±5.36％;實(shí)驗(yàn)組則為12.07％±12.70％。在使用美羅培南1小時(shí)以后,腦脊液中可測(cè)得其濃度,在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)上,實(shí)驗(yàn)組的穿透率高于對(duì)照組。
　　 討論：
　　 血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)是機(jī)體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervous Syste

14、m,CNS)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其結(jié)構(gòu)的完整或改變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理研究有著重要意義。血腦屏障位于血液與CNS的神經(jīng)組織之間,限制某些物質(zhì)進(jìn)入腦組織,是由CNS無(wú)窗孔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接、基膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞腳板和極狹小的細(xì)胞外隙共同組成的一個(gè)細(xì)胞復(fù)合體。其功能、形態(tài)學(xué)的主要基礎(chǔ)是覆蓋在CNS毛細(xì)血管腔面的腦內(nèi)皮細(xì)胞,具有高度選擇性,能防止毒素及其他有害物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。在多種原因造成的腦損害時(shí),常最先表現(xiàn)為血腦屏

15、障的開(kāi)放。血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血循環(huán)之間物質(zhì)交換的調(diào)節(jié)器,由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成的,其中內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)。腦的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞底面是一薄而連續(xù)的基膜,底面和基膜之間僅有一狹小的間隙?；в幸欢ǖ呢?fù)電荷,由微纖維形成網(wǎng)狀骨架。腦毛細(xì)血管周?chē)哂幸粚泳o密包繞的神經(jīng)膠質(zhì)鞘,由星形膠質(zhì)細(xì)胞突起組成,突起之間有不連續(xù)的裂隙。血腦屏障可阻止多種物質(zhì)進(jìn)入腦,它對(duì)于非必需的或有害的循環(huán)成分來(lái)說(shuō)是一道屏障,但

16、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物可順利通過(guò),以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。其它非神經(jīng)組織中毛細(xì)血管壁上的內(nèi)皮細(xì)胞之間存在大量直徑約為50nm的跨細(xì)胞孔或裂隙,水、電解質(zhì)以及部分大分子物質(zhì)可自由通過(guò)。與之不同的是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間存在著緊密連接,有效孔徑僅為(1.4～1.8)×10-11m,血液中的物質(zhì)不能從細(xì)胞連接的空隙中通過(guò)。腦內(nèi)皮細(xì)胞只有少量?jī)?nèi)吞泡,內(nèi)吞活性很低,進(jìn)一步限制了物質(zhì)跨細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。由于血腦屏障的這些獨(dú)特結(jié)構(gòu),使得大腦在吸收外界物質(zhì)

17、時(shí)十分地嚴(yán)謹(jǐn)和挑剔,不僅對(duì)所吸收分子的大小有限制,而且對(duì)它們所負(fù)的電荷和溶解性有要求。這就避免了大腦受到血液循環(huán)中有害物質(zhì)如毒素和病毒的侵害。但是這層屏障同時(shí)也阻礙了許多有潛在價(jià)值的藥物進(jìn)入大腦。一般來(lái)講,只有那些親脂性的分子量小于500D的小分子才能順利通過(guò)血腦屏障。
　　 蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)主要的病理生理改變可能與血腦屏障(BBB)的破壞和腦水腫的形成有關(guān),有學(xué)者認(rèn)為引起上述病理改變可能與SAH后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。

18、SAH后,早期即出現(xiàn)平滑肌劇烈收縮,內(nèi)彈力膜及內(nèi)皮細(xì)胞隨之皺縮致血管腔狹窄,內(nèi)皮細(xì)胞在早中期只發(fā)生輕度腫脹或變性,晚期血管舒張恢復(fù)可出現(xiàn)內(nèi)皮脫落,內(nèi)彈力膜斷裂和分布不均勻以及平滑肌細(xì)胞部分退性變。另外,SAH當(dāng)時(shí)和SAH后早期顱內(nèi)壓升高引起組織供血供氧不足也可能是BBB開(kāi)放的原因,蛛網(wǎng)膜下腔的血液中的某些成分和分解產(chǎn)物直接作用于腦微血管或啟動(dòng)自由基反應(yīng)、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)炎癥反應(yīng)以及凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),使腦微血管通透性增加,從而引起B(yǎng)BB損傷。G

19、emano等研究報(bào)道,血腦屏障的通透性在蛛網(wǎng)膜下腔出血36h開(kāi)始增加,48h達(dá)到高峰,72h恢復(fù)正常。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)測(cè)量腦脊液中美羅培南濃度間接反映血腦屏障在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的改變。實(shí)驗(yàn)中家兔的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的建立采用二次注血法,在完成第二次注血后靜脈應(yīng)用美羅培南,于血腦屏障的開(kāi)放期內(nèi)采集腦脊液樣本,樣本測(cè)量結(jié)果證實(shí),蛛網(wǎng)膜下腔出血后家兔的腦脊液中美羅培南的藥物濃度要高于血腦屏障未受損的正常組,此結(jié)果亦可證明在蛛網(wǎng)膜下腔出血的急