MDCK轉(zhuǎn)染MDR1作為血腦屏障藥物透過的快速篩選模型的研究.pdf

1、血腦屏障(BBB)是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)在星狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞誘導(dǎo)下共同組成的一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，是對分子進(jìn)入腦內(nèi)起選擇作用最重要的屏障。 BMECs在結(jié)構(gòu)上與外周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞不同，它連接緊密，缺乏孔道，胞飲泡、吸收外排蛋白以及代謝酶少，這些特性使得BBB選擇性地限制藥物進(jìn)入CNS。因此，越來越需要建立一個(gè)簡單、應(yīng)用廣泛的體外方法來預(yù)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物透過BBB的特性。MDCK細(xì)胞系為馬丁達(dá)比狗腎上皮細(xì)胞，現(xiàn)已作為B

2、BB體外模型用于研究藥物被動(dòng)透過和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞系。 MDCK-MDR1細(xì)胞系是由MDCK細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人源MDR1基因，過表達(dá)極性化分布的P-gp的細(xì)胞系。與這個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系相比，MDCK細(xì)胞中的內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)體可以忽略，因此它可用于研究P-gp介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。 MDCK-MDR1細(xì)胞模型是用于測定新化學(xué)實(shí)體CNS透過性的理想BBB體外快速篩選模型，可用于指導(dǎo)藥物的發(fā)現(xiàn)。 因此該細(xì)胞系是預(yù)測藥物大腦分布，以及判斷藥物

3、進(jìn)入BBB是通過被動(dòng)擴(kuò)散還是經(jīng)P-gp主動(dòng)外排機(jī)制的一個(gè)有效模型。 1P-gp高表達(dá)MDCK細(xì)胞系的建立為建立能穩(wěn)定表達(dá)人源P-gp的MDCK轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，并鑒定其是否適用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MDR1通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染犬腎上皮細(xì)胞MDCK，經(jīng)G418篩選獲得抗性克隆。通過P-gp的熒光底物Rho123在各單克隆細(xì)胞內(nèi)的積聚量以及維拉帕米存在時(shí)細(xì)胞內(nèi)Rho123積聚量檢

4、測P-gp的活性。 RT-PCR和Westernblot檢測人源MDR1的mRNA和P-gp表達(dá)量。應(yīng)用篩選出的MDCK-MDR1單克隆細(xì)胞株，研究了Rho123在MDCK和MDCK-MDR1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)及四種經(jīng)典抑制劑(維拉帕米、環(huán)孢素、酮康唑和奎寧)對Rho123轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制特性。RT-PCR和Westernblot檢測表明，所建立的MDCK-MDR1細(xì)胞與MDCK細(xì)胞相比，經(jīng)轉(zhuǎn)染后MDCK細(xì)胞(MDCK-MDR1)內(nèi)的人源M

5、DR1的mRNA和P-gp表達(dá)發(fā)生從無到有的變化。 Rho123在MDCK和MDCK-MDR1中的外排率分別是5.94和15.45，抑制劑能顯著地抑制細(xì)胞外排作用。因此，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞高表達(dá)P-gp，適用于研究藥物的腸道和血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。 2血腦屏障藥物透過的快速篩選 2.1BYYT系列化合物的透過性研究BYYT是一系列乙酰膽堿酯酶抑制劑，是用于治療阿爾茨海默病的一類藥物，此類藥物的療效與其在CNS分布情況密切相

6、關(guān)，但是它們是否能透過BBB進(jìn)入CSN尚未確定。 本實(shí)驗(yàn)主要是利用MDCK和MDCK-MDR1細(xì)胞作為BBB的體外模型研究四種BYYT化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)透過特性。 通過檢測BYYT在MDCK和MDCK-MDR1單細(xì)胞層上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)以確定它們是否為P-gp的底物或是抑制劑。應(yīng)用HPLC定量分析BYYT，測定在10、50、100μmol/L時(shí)BYYT的表觀透過系數(shù)(Papp)，考察BYYT(1-200μmol/L)對Rho123在

7、MDCK和MDCK-MDR1細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 結(jié)果顯示，BYYT在兩種細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并無顯著性差異，凈外排率都小于2，它們并不是P-gp的底物，Papp(A-B)值在0.94-2.41×10-5cm/s范圍之間。另外四種BYYT對P-gp介導(dǎo)的Rho123轉(zhuǎn)運(yùn)都有抑制作用，IC50分別為49.43、39.81、54.08和43.85μmol/L。 實(shí)驗(yàn)證明，多藥耐藥功能對BYYT系列化合物的吸收和大腦分布不受P-gp

8、影響，易透過BBB進(jìn)入大腦。BYYT與P-gp相互作用的藥理活性結(jié)構(gòu)部位很可能是二甲氧基茚酮。 2.2天麻素及其苷元的透過性研究為了評價(jià)GAS和天麻素苷元HBA透過CNS的能力和在BBB中是否發(fā)生由P-gp介導(dǎo)的外排，測定了兩者在MDCK和MDCK-MDR1細(xì)胞上的透過情況。 我們應(yīng)用體外模型測定GAS和HBA在BBB的透過率，采用HPLC檢測方法檢測兩種化合物濃度為100、150和200μmol/L時(shí)在MDCK和MDC

9、K-MDR1單細(xì)胞層上的透過量。測定P-gp的兩種抑制劑維拉帕米和CsA對10.0μmol/LGAS的抑制作用，以及研究GAS和HBA在兩種細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)積聚差異。結(jié)果表明：HBA在兩種細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并無顯著性差異，Papp(A-B)值在2.06-2.83×10-5cm/s范圍之間。而GAS則呈現(xiàn)外排現(xiàn)象，凈外排率為1.92、1.53和1.39。GAS的吸收透過系數(shù)值在1.63-1.83×10-7cm/s之間。GAS在MDCK-MDR

10、1細(xì)胞內(nèi)的吸收量比MDCK細(xì)胞內(nèi)的小4倍左右。P-gp的抑制劑維拉帕米和CsA可以抑制GAS的外排作用。體外實(shí)驗(yàn)證明HBA不是P-gP的底物，它有很強(qiáng)的BBB透過能力。而GAS通過由P-gp介導(dǎo)的外排機(jī)制，使其CNS透過量受到很大的限制，難透過BBB，大腦攝取量非常低。 2.3Roeh系列化合物的透過性研究為了評價(jià)五種Roch系列化合物在BBB中是否參與P-gp介導(dǎo)的外排，測定了它們在MDCK和MDCK-MDR1細(xì)胞上的透過情況

11、。我們在兩種細(xì)胞種板5天后進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。采用HPLC檢測方法檢測五種化合物在MDCK和MDCK-MDR1單細(xì)胞層上的透過量。測定在10、50、100μmol/L時(shí)幾種化合物的Papp值，以及P-gp的兩種抑制劑維拉帕米和CsA對10μmol/LRoch-2和109mol/LRoch-5的抑制作用。 結(jié)果顯示：Roch-1、Roch-3和Roch-4在兩種細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并無顯著性差異，凈外排率都小于2，它們并不是P-gp的底物，

12、Papp(A-B)值在0.37-2.63×10-5cm/s范圍之間。Roch-2和Roch-5在MDCK-MDR1細(xì)胞上的外排率以及凈外排率大于2。 它們的Papp(A-B)值分別在0.55-1.06×10-5cm/s和0.89-1.33×10-6cm/s之間。維拉帕米和CsA可以抑制兩個(gè)化合物的外排作用。 實(shí)驗(yàn)證明，Roch-1、Roch-3和Roch-4有較強(qiáng)的BBB透過能力，而Roch-2和Roch-5是P-gp的