女性生殖道新抗菌肽的純化及鑒定.pdf

1、【背景】抗菌肽是天然免疫的重要介質(zhì)，由機(jī)體自身基因編碼產(chǎn)生，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等生物學(xué)活性。女性生殖系統(tǒng)也是天然免疫的重要場所，迄今在女性生殖道中己鑒定出有多種抗菌肽或抗菌蛋白分子存在，例如防御素、溶菌酶、乳鐵蛋白、白細(xì)胞蛋白酶抑制劑等。是否還存在新的抗菌蛋白或肽分子，目前仍然受到學(xué)者們的關(guān)注?，F(xiàn)今已鑒定出的女性生殖道抗菌肽或抗菌蛋白來源于上皮細(xì)胞和/或白細(xì)胞，這些天然抗菌分子是否有新的細(xì)胞來源，也是令人感興趣的問題。因此本研究

2、對人子宮內(nèi)膜粘液和子宮頸粘液的酸溶性提取物進(jìn)行分離純化，力圖鑒定出新的抗菌肽分子，并對所鑒定出的抗菌肽分子的細(xì)胞來源、組織學(xué)分布也進(jìn)行了分析。此外，抗菌肽分子具有固有或誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)，因此我們對新鑒定出的分子在臨床炎癥和非炎癥狀態(tài)下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，以期進(jìn)一步了解女性生殖道的天然免疫機(jī)制，并為其將來用于臨床女性生殖道感染防治打下基礎(chǔ)。 【方法與結(jié)果】對收集的子宮內(nèi)膜粘液和子宮頸粘液酸溶性提取物分別進(jìn)行制備性酸性尿素聚丙烯酰胺

3、凝膠電泳(AU-PAGE)，并用電泳瓊脂糖彌散法檢測其抗菌條帶，切下相應(yīng)的抗菌條帶進(jìn)行洗脫電泳。洗脫物透析凍干后，重溶于0.01％乙酸，于-20℃保存?zhèn)溆谩?凍存的子宮內(nèi)膜洗脫樣品經(jīng)反相高效液相色譜(HPLC)分離，在第39分鐘保留時(shí)間純化出一個(gè)分子，命名為HUP-39。Edman降解法測定其N端前10個(gè)氨基酸序列為FLSFPTTKTY，經(jīng)GenBankBLAST程序檢索，其序列與血紅蛋白α鏈(hHEM-α)N端第33-42氨基

4、酸完全相同，但未檢索出與其它的任何蛋白分子同源；質(zhì)譜儀檢測其分子量為6776.8-6777.1Da之間；根據(jù)N端序列和質(zhì)譜分析結(jié)果，HUP-39分子應(yīng)為hHEM-αN端第33-95的氨基酸殘基片段。ExPASy和OMIGA生物軟件對該片段氨基酸殘基組成、等電點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域分析表明：該片段富含堿性氨基酸，其等電點(diǎn)為8.38，包含3個(gè)完整的α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域。瓊脂糖彌散法檢測顯示HUP-39對大腸桿菌安芐青霉素耐藥株ML-35p、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株A

5、TCC25922和臨床分離株54080有較強(qiáng)的抑菌活性，而對金黃色葡萄球菌ATCC25923及白色念珠菌ATCC90028未檢測到抑菌活性。 凍存子宮頸粘液洗脫樣品通過HPLC分離，在第21分鐘出峰時(shí)間(保留時(shí)間)純化出一個(gè)分子，命名為HCP-21。該分子對大腸桿菌安芐青霉素耐藥株ML-35p有較強(qiáng)的抑菌活性。經(jīng)N端氨基酸序列分析并通過BLAST檢索發(fā)現(xiàn)，HCP-21N-端前10個(gè)氨基酸與HMGN2N-端第2-11個(gè)氨基酸同一性

6、為100％(氨基酸序列為：PKRKAEGDAK)；質(zhì)譜檢測HCP-21分子量為9263.62Da，與HMGN2理論分子量完全一致，因此可確定該分子為HMGN2。提取原代培養(yǎng)宮頸上皮細(xì)胞的總RNA，以HMGN2cDNA序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出一條270bp目的基因片段，與HMGN2cDNA大小相同。表明在生理狀況下，宮頸上皮細(xì)胞即可表達(dá)其mRNA。用親和純化的重組HMGN2質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白GST-HMGN2，免疫新西蘭大

7、白兔，以制備HMGN2多克隆抗體。其后對生理狀態(tài)下宮頸組織切片和宮頸粘液涂片進(jìn)行HMGN2分子免疫組化分析表明，該分子存在于子宮頸粘液，并主要分布于子宮頸粘膜層。免疫打點(diǎn)雜交顯示HMGN2炎癥組與非炎癥組標(biāo)本HMGN2含量無統(tǒng)計(jì)意義差異，表明該分子無誘導(dǎo)表達(dá)特性。 【結(jié)論】HUP-39是人血紅蛋白α鏈片段，具有抗革蘭氏陰性菌作用。我們認(rèn)為子宮內(nèi)膜粘液中的抗菌分子不僅來源于上皮細(xì)胞和白細(xì)胞，也可來源于紅細(xì)胞。HCP-21是HMGN