斑馬魚(yú)Mi1-s1pr2和vmhc基因的功能研究及藥源性心臟毒性模型的建立.pdf

1、心血管疾病是威脅人類(lèi)健康的最常見(jiàn)疾病，且造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。治療心血管疾病的新藥研發(fā)一直是藥學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)重點(diǎn)。然而與之相配套的藥物毒性的早期篩查和預(yù)測(cè)的新模型和技術(shù)系統(tǒng)，仍相對(duì)落后。一種具有心臟風(fēng)險(xiǎn)的新藥的上市和撤市，除造成人員生命財(cái)產(chǎn)的損失外，還導(dǎo)致藥物研發(fā)領(lǐng)域人力、物力和時(shí)間的巨大浪費(fèi)。因而，建立一個(gè)靈敏、準(zhǔn)確、高通量、可早期介入的藥物心臟安全性的體內(nèi)評(píng)價(jià)系統(tǒng)，尤為重要和必要。
　　斑馬魚(yú)是一種脊椎類(lèi)的小型模式動(dòng)物，繁殖力強(qiáng)，

2、體外受精和發(fā)育，其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程、組織系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)有很高的相似性，在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上也具有很高的保守性。目前已經(jīng)具有成熟的斑馬魚(yú)細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)、突變技術(shù)、基因活性移植技術(shù)和顯微注射技術(shù)等各種分子生物學(xué)技術(shù)。因此斑馬魚(yú)成為研究人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、預(yù)防和治療，以及新藥研發(fā)的優(yōu)良模式動(dòng)物。尤其是斑馬魚(yú)的心臟結(jié)構(gòu)清晰，易于觀察;雖然其心臟為兩腔心臟——一房一室，但其發(fā)生和發(fā)育路線及相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制與人類(lèi)接近，在胚胎和幼體階段心臟位于

3、體表，非常適于進(jìn)行心臟疾病模型和心臟毒理的研究。因此，本研究選用斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物建立藥物心臟毒性的檢測(cè)模型。本論文的主要成果如下:
　　1.首次克隆了斑馬魚(yú)1-磷酸鞘安醇受體2(mil/slpr2)基因的啟動(dòng)子調(diào)控序列;通過(guò)基因上游序列分段缺失、基因knock-down和knock-up等基因分析實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)mil基因在斑馬魚(yú)的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、側(cè)線系統(tǒng)和聽(tīng)力等方面的發(fā)育過(guò)程中具有非常重要的生物學(xué)功能，mil基因表達(dá)異常時(shí)，將會(huì)

4、造成上述系統(tǒng)或器官的發(fā)育畸形或異常。尤其是首次證明了mil基因的失調(diào)與聽(tīng)覺(jué)相關(guān)基因和毛細(xì)胞損傷密切相關(guān)。
　　2.克隆了斑馬魚(yú)心室肌球蛋白重鏈(vmhc)基因的調(diào)控序列，并構(gòu)建了vmhc基因啟動(dòng)子序列指導(dǎo)的綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)的載體，制備了EGFP熒光在心臟區(qū)域特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型，目前已獲得F2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因幼體。結(jié)果表明本研究已初步獲得了心臟標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)株。
　　3.藥物心臟毒性的斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)模型。利用具有心