激活CB2R對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的防治作用.pdf

1、研究目的:
　　 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的疾病特征是關(guān)節(jié)滑膜炎癥持久反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘疾。其主要的組織病理學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為T(mén)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like synoviocytes，簡(jiǎn)稱(chēng)FLS）等聚集致關(guān)節(jié)滑膜增生增厚。近年來(lái)研究表明，F(xiàn)LS在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起著主導(dǎo)作用。盡管目前臨床上對(duì)于RA

2、的治療已有很大的提高，但是依然有部分RA病人對(duì)現(xiàn)有的藥物和治療策略不敏感，因此對(duì)于新的治療靶點(diǎn)，尤其是在炎癥調(diào)節(jié)通路上新靶點(diǎn)的研究就顯得意義重大。Ⅱ型大麻素受體(Cannabinoid receptor2，簡(jiǎn)稱(chēng)CB2R)主要表達(dá)在外周免疫系統(tǒng)中，近年來(lái)由于其顯著地抗炎效果在許多疾病領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，包括多發(fā)性硬化癥，過(guò)敏性接觸性皮炎等。同時(shí)由于其激動(dòng)后不產(chǎn)生中樞神經(jīng)體統(tǒng)方面的副作用，因此越來(lái)越多的CB2R特異性激動(dòng)劑成為基礎(chǔ)研究和臨床研

3、究中關(guān)注的焦點(diǎn)。本課題的研究目的在于探究CB2R能否成為治療RA的新靶點(diǎn)，特異性激動(dòng)CB2R能否治療RA，以期為臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 本研究首先用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，簡(jiǎn)稱(chēng)IHC）、免疫熒光（Immunofluorescece，簡(jiǎn)稱(chēng)IF）、免疫印跡（Western blot，簡(jiǎn)稱(chēng)WB）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Revers transcription pol

4、ymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR)等分子生物學(xué)方法在RA病人滑膜中定性研究CB2R的表達(dá)情況。利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)和WB檢測(cè)在不同的炎性刺激下CB2R表達(dá)的調(diào)節(jié)情況。在定性研究得到肯定結(jié)果后，以膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型(Collagen-inducedarthritis，簡(jiǎn)稱(chēng)CIA)為主要的動(dòng)物模型，在整體上，利用CB2R激動(dòng)劑HU-308，研究CB2R被激動(dòng)后是否可以有效防

5、治實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎;從第二次免疫前一天開(kāi)始（第20天開(kāi)始），給于不同劑量的HU-308，連續(xù)給藥七天，觀察指標(biāo)包括小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度（根據(jù)炎癥半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每隔一天記錄一次）、關(guān)節(jié)組織被破壞的程度（HE染色，X-光照射和Micro-CT）及血清中抗Ⅱ型膠原抗體的表達(dá)情況（免疫酶聯(lián)吸附反應(yīng)，Enzeyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA）。接著在原代培養(yǎng)的RA病人FLS細(xì)胞上，利用Real-time PC

6、R和ELISA，分別在基因水平和蛋白水平上從炎癥因子和MMPs兩方面研究HU-308防治RA的細(xì)胞和分子機(jī)制，同時(shí)也研究了HU-308對(duì)FLS增殖的影響;并利用CB2R基因敲除鼠，在腹腔巨噬細(xì)胞上驗(yàn)證HU-308激活CB2R特異性。最后在RA病人FLS上，用WB的分子生物學(xué)方法初步探究HU-308發(fā)揮作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化結(jié)果表明在RA病人和骨關(guān)節(jié)炎(Osteroarthriti

7、s，簡(jiǎn)稱(chēng)OA)病人的滑膜組織中，巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和FLS均有CB2R的表達(dá);且相比較于OA，CB2R在RA滑膜中有表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)。在原代培養(yǎng)的RA病人FLS中，IF, WB和PCR的結(jié)果也定性證明了CB2R在RA病人滑膜中的存在。另外，炎癥刺激因子IL-6，TNF-α和LPS能夠上調(diào)FLS中CB2R的表達(dá)。此外我們還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常小鼠而言，在CIA小鼠的脾臟和肝臟中，CB2R的表達(dá)也顯著上調(diào)，提示在病理性炎癥過(guò)程中，CB2R可能會(huì)反

8、饋性的表達(dá)上調(diào)來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。
　　 2.在動(dòng)物整體上，對(duì)炎癥的半定量評(píng)分結(jié)果表明，1 mg/kg劑量的HU-308治療可以有效減輕CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度，延緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展;HE染色結(jié)果顯示1 mg/kg劑量的HU-308能減少關(guān)節(jié)滑膜的病理性增厚,防治關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細(xì)胞的侵潤(rùn);X-光片和Micro-CT結(jié)果顯示1.0 mg/kg的HU-308治療能減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞程度;同時(shí)ELISA結(jié)果顯示1 mg/kg

9、治療組中小鼠血清中抗Ⅱ型膠原抗體（包括總的IgG， IgG1， IgG2a， IgG2b）的水平明顯降低。但0.3 mg/kg劑量的HU-308沒(méi)有觀察到明顯的治療效果。
　　 3.在原代FLS中，HU-308能劑量依賴(lài)性地（1-10μM）從基因和蛋白水平抑制IL-1β誘導(dǎo)的IL-6，MMP-3，MMP-13的表達(dá)以及IL-1β誘導(dǎo)的FLS的增殖。
　　 4.在原代野生型腹腔巨噬細(xì)胞中，HU-308能劑量依賴(lài)性地抑制脂多

10、糖（Lipopolysaccharide，簡(jiǎn)稱(chēng)LPS）誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)，在CB2R敲除的腹腔巨噬細(xì)胞中，HU-308的這一抑制作用被取消，表明CB2R介導(dǎo)了HU-308的抗炎效果。
　　 5.信號(hào)通路的初步探究表明，有效劑量的HU-308(10μM)能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的FLS中ERK1/2， p38 MAPK的磷酸化，提示HU-308在關(guān)節(jié)炎中的作用可能與上述兩種信號(hào)分子介導(dǎo)的調(diào)節(jié)通路有關(guān)。