EPC在D發(fā)病及治療中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究通過建立Wistar大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)模型并檢測(cè)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)的數(shù)量及功能變化，探討EPC在DR發(fā)病機(jī)制中的作用;進(jìn)而應(yīng)用辛伐他汀動(dòng)員大鼠DR模型體內(nèi)EPC，觀察其對(duì)大鼠DR模型視網(wǎng)膜病變的修復(fù)作用及機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照(CON)組

2、(14只鼠)和糖尿病(DM)組(36只鼠)。通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立DR模型，根據(jù)病程，將DM組大鼠再分為糖尿病1個(gè)月(DM1)組、糖尿病3個(gè)月(DM3)組、糖尿病6個(gè)月(DM6)組，每組各12只。同時(shí)于各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)摘除大鼠眼球行蘇木精-伊紅(HE)染色，采用免疫組織化學(xué)法分析血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)，透射電子顯微鏡進(jìn)行視網(wǎng)膜病理組織學(xué)檢查。
　　 (2)根據(jù)前一部分DR大鼠模型，采用密度梯度

3、離心法從各組大鼠骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板;培養(yǎng)7d后，利用Dil-acLDL和FITC-UEA-(I)細(xì)胞熒光染色法及流式細(xì)胞儀CD34和CD133抗體標(biāo)記法鑒定EPC。在倒置相差顯微鏡下對(duì)EPC計(jì)數(shù)克隆形成單位(CFU)，以評(píng)估骨髓EPC的數(shù)量水平;采用MTT比色法、Transwell小室和粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀察EPC的增殖、遷移和粘附能力。
　　 (3)雄性Wistar大鼠80只，以隨機(jī)數(shù)字表法分

4、為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、安慰劑組、辛伐他汀組，每組各20只大鼠。實(shí)驗(yàn)組采用腹腔注射STZ建立DR大鼠模型。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組不給予任何干預(yù);辛伐他汀組予辛伐他汀20mg/kg灌胃，1次/d;安慰劑組給予等量蒸餾水灌胃，1次/d。分別于1、4及12周時(shí)取靜脈血，采用流式細(xì)胞儀分別計(jì)數(shù)各組大鼠外周血EPC數(shù)量的變化。于12周時(shí)處死大鼠，摘除眼球行HE染色，采用伊文思藍(lán)(EB)定量檢測(cè)血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）的破壞程度，免疫組織化學(xué)法分

5、析CD31在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)及透射電子顯微鏡進(jìn)行視網(wǎng)膜病理組織學(xué)檢查。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及血管生成素-1(Ang-1)在視網(wǎng)膜的表達(dá)。對(duì)比分析EPC的數(shù)量改變與視網(wǎng)膜病理變化的相互關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 (1)DM大鼠血糖明顯升高，體重明顯下降。DM1、DM3組視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜厚度變薄，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核腫脹、體積增大，DM6組

6、視網(wǎng)膜厚度更薄，細(xì)胞排列紊亂更加明顯，部分血管擴(kuò)張。DM1、DM3、DM6組視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)較CON組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM1組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞核膜輕微凹陷，異染色質(zhì)聚集靠邊。DM3組內(nèi)皮細(xì)胞水腫，毛細(xì)血管基底膜增厚，電子密度明顯增大。DM6組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變形，基底膜增厚顯著，管腔明顯狹窄，甚至閉塞。
　　 (2) DM1、DM3、DM6組大鼠骨髓來源EPC-CFU數(shù)量、EPC增殖能力、遷移能力及粘附能力較

7、CON組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)注射STZ后1、4、12周時(shí)安慰劑組大鼠外周血EPC計(jì)數(shù)均降低;注射STZ后1、4、12周時(shí)辛伐他汀組大鼠外周血EPC計(jì)數(shù)明顯高于模型對(duì)照組和安慰劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型對(duì)照組和安慰劑組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞水腫，基底膜增厚顯著，電子密度增加，周細(xì)胞線粒體腫脹，嵴消失;辛伐他汀組大鼠視網(wǎng)膜各層組織水腫減輕，內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞核膜輕微凹陷，異染色質(zhì)聚集靠邊，管腔未變形。

8、模型對(duì)照組和辛伐他汀組大鼠視網(wǎng)膜平均EB滲漏量較正常對(duì)照組顯著增加，辛伐他汀組較模型對(duì)照組明顯減少;CD31在正常對(duì)照組表達(dá)為弱陽性，辛伐他汀組表達(dá)強(qiáng)度較模型對(duì)照組增強(qiáng);eNOS在模型對(duì)照組表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減弱，辛伐他汀組表達(dá)強(qiáng)度較模型對(duì)照組增強(qiáng);iNOS和Ang-1在模型對(duì)照組表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)，辛伐他汀組表達(dá)強(qiáng)度較模型對(duì)照組減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 (1)糖尿病大鼠骨髓EPC數(shù)量較正常