慢病毒介導(dǎo)Ⅰ型膠原shRNA在大鼠系膜細(xì)胞中的表達(dá)及導(dǎo)入方法的探索.pdf

1、腎臟纖維化是糖尿病腎病等慢性腎臟疾病終末期的病理變化特征，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚，其中Ⅰ型膠原的過度表達(dá)在該過程中起到重要作用。利用RNA干涉技術(shù)下調(diào)Ⅰ型膠原基因的過度表達(dá)，以期成為延緩腎臟纖維化的新方法。 第一部分質(zhì)粒介導(dǎo)Ⅰ型膠原shRNA在大鼠系膜細(xì)胞中的表達(dá) 目的：利用Ⅰ型膠原shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞，觀察其轉(zhuǎn)染效率及干涉效率，驗證進(jìn)一步合成慢病毒表達(dá)載體的可能性。方法：依照前期研究證實的Ⅰ型膠原基

2、因序列，合成攜帶非特異性綠色熒光蛋白基因的大鼠Ⅰ型膠原shRNA質(zhì)粒，并用其轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下觀察大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，并利用RT-PCR觀察其對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)果：Ⅰ型膠原shRNA的質(zhì)粒載體能有效轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率為52.2％。將Ⅰ型膠原shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞，與空白對照組及陰性對照組比較，shRNA組可見特異性513bpCOLⅠ基因條帶減暗。表明Ⅰ型膠原shRNA使Ⅰ型膠

3、原表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：質(zhì)粒載體可以有效地將shRNA轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞，并使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，從而可以利用三質(zhì)粒法進(jìn)一步合成慢病毒表達(dá)載體。 第二部分慢病毒介導(dǎo)Ⅰ型膠原shRNA在大鼠系膜細(xì)胞中的表達(dá) 目的：將表達(dá)Ⅰ型膠原shRNA的慢病毒感染大鼠系膜細(xì)胞，觀察其轉(zhuǎn)染效率、干涉效率。方法：利用已驗證的表達(dá)質(zhì)粒合成慢病毒表達(dá)載體，并用其感染大鼠系膜細(xì)胞，流式細(xì)胞儀下觀察大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，并利用RT-PCR和Western

4、 blot分別在RNA水平和蛋白質(zhì)水平觀察其對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)果：Ⅰ型膠原shRNA的慢病毒載體能高效感染大鼠系膜細(xì)胞，感染效率高達(dá)75.42％。對感染后大鼠系膜細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和Western blot檢測，與空白對照組及陰性對照組比較，shRNA組可見COLⅠ基因條帶及蛋白電泳條帶均明顯減暗，表明Ⅰ型膠原shRNA慢病毒表達(dá)載體可以使Ⅰ型膠原表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：慢病毒載體能夠穩(wěn)定高效地將shRNA轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)錄

5、水平和蛋白質(zhì)水平均能檢測到明顯的抑制作用，為進(jìn)一步慢病毒載體動物實驗進(jìn)行了細(xì)胞水平的探索。 第三部分慢病毒介導(dǎo)Ⅰ型膠原shRNA對大鼠系膜細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的：通過觀察慢病毒介導(dǎo)的Ⅰ型膠原shRNA感染大鼠系膜細(xì)胞后其增殖、凋亡及細(xì)胞周期的變化，探索未來應(yīng)用于動物實驗，甚至臨床時Ⅰ型膠原的RNAi藥物對靶細(xì)胞生物學(xué)影響。方法：針對空慢病毒及COLⅠ shRNA表達(dá)慢病毒感染后的大鼠系膜細(xì)胞，分別用MTT法和直接計數(shù)

6、法檢測細(xì)胞增殖，利用Annexin V-PE/7-AAD法檢測細(xì)胞凋亡，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，進(jìn)而觀察空慢病毒及慢病毒表達(dá)載體對細(xì)胞上述生物學(xué)特性的影響。結(jié)果：慢病毒表達(dá)載體組和空慢病毒組均能顯著抑制細(xì)胞增殖，且慢病毒表達(dá)載體抑制能力又顯著高于空病毒。凋亡實驗結(jié)果表明，慢病毒感染細(xì)胞后未見明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且做為載體攜帶的COLⅠ shRNA也未引起細(xì)胞凋亡加劇。細(xì)胞周期實驗發(fā)現(xiàn)慢病毒引起細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。而在72小時C

7、OLⅠshRNA對S期的阻滯逐漸突出。結(jié)論： COLⅠ shRNA對S期的阻滯引起細(xì)胞增殖能力的下降，從而使系膜細(xì)胞異常增生得到抑制，有利于緩解腎臟纖維化。而在細(xì)胞凋亡方面，無論慢病毒本身還是COLⅠ shRNA的RNAi作用，均未引起細(xì)胞凋亡增加，說明了該表達(dá)載體的安全性。同時慢病毒由于其自身的毒性造成MC一定程度的G2/M期阻滯，可能對腎臟纖維化的控制有部分幫助。 第四部分慢病毒介導(dǎo)Ⅰ型膠原shRNA導(dǎo)入大鼠方法學(xué)探索

8、 目的：探索將shRNA表達(dá)慢病毒高效導(dǎo)入大鼠腎臟的方法，為進(jìn)一步動物實驗及臨床研究提供平臺。方法：通過腹腔注射和腎臟實質(zhì)注射將shRNA表達(dá)慢病毒導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，利用倒置熒光顯微鏡觀察腎臟內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)，從而比較兩種方法對慢病毒感染腎臟的效果。結(jié)果：腹腔注射法和腎臟實質(zhì)注射法均能將shRNA表達(dá)慢病毒導(dǎo)入腎臟，但腹腔注射法對腎臟的靶向性導(dǎo)入效果欠佳，將病毒劑量增加至108TU數(shù)量級仍不能在腎內(nèi)檢測到綠色熒光蛋白表達(dá)。腎臟實質(zhì)注射