電離輻射對人紅白血病細(xì)胞系增殖與凋亡影響的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 目的:探討人紅白血病細(xì)胞K562及其耐藥細(xì)胞系K562/AO2放射敏感性和亞致死損傷修復(fù)能力的差異。 方法:體外培養(yǎng)人白血病細(xì)胞系K562及K562/AO2,取對數(shù)生長期細(xì)胞分組進行實驗。實驗分兩大組:即K562組與K562/AO2組,各組依照射劑量的不同分為8個亞組:0、1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy,每個劑量組設(shè)3個平行樣本。接種于1%甲基纖維素半固體培養(yǎng)基,按劑量照射并培養(yǎng)14天

2、即行集落形成實驗。根據(jù)各組接種的細(xì)胞數(shù)、形成的集落數(shù),計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù),用GraphPad Prism 4.0軟件單靶多擊或多靶單擊模型擬合劑量-存活曲線,分別得到相關(guān)參數(shù)Do值(平均致死劑量,即殺死63%的細(xì)胞所需的照射劑量)、Dq值(準(zhǔn)閾劑量,表示從開始照射到細(xì)胞呈指數(shù)死亡所“浪費”的劑鼉)、N值(外推數(shù),extrapolation number,細(xì)胞內(nèi)所含的放射敏感靶數(shù)),分析K562及K562/AO2的亞致死損傷修復(fù)能力及其放射

3、敏感性的差異。 結(jié)果:細(xì)胞存活曲線的相關(guān)參數(shù)顯示:1.K562及K562/AO2經(jīng)2Gy照射后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)分別為0.3077與0.3393,N值分別為1.062與1.072,Do值分別為2.35與2.84。2.兩種細(xì)胞的Dq值分別為0.141與0.198。 結(jié)論: 1.K562輻射敏感性是K562/AO2的1.1~1.2倍,提示K562/AO2與K562的輻射敏感性稍有差異,臨床復(fù)發(fā)產(chǎn)生耐藥的人紅白血病

4、患者接受放療時應(yīng)考慮這種差異; 2.人紅白血病無論足耐藥細(xì)胞株K562/AO2與非耐藥細(xì)胞株K562兩者照射后其亞致死損傷修復(fù)能力均較差,對射線均較敏感。 第二部分 目的:探討低劑量照射及低劑量聯(lián)合大劑量照射對人紅白血病細(xì)胞系K562增殖與凋亡的影響,并探討其可能的作用機制。 方法:體外培養(yǎng)人白血病細(xì)胞K562,取對數(shù)生長期細(xì)胞分瓶分組分別給予不同劑量的6MV-X射線照射。實驗根據(jù)照射劑量不同分4大組:空

5、白對照組(0cGy),低劑量照射組(LDR:8cGy、20cGy、50cGy、80cGy)、大劑量照射組(HDR:600cGy)及低劑量聯(lián)合大劑量照射組(LDR+HDR:8cGy+600cGy、20cGy+600cGy、50cGy+600cGy、80cGy+600cGy),每個亞組設(shè)3個平行樣本。照射后按不同時間點收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布、凋亡率、線粒體膜電位(△ψm)變化,Western Blotting檢測Bcl-xl、

6、Bax、p53蛋白表達情況,酶標(biāo)儀檢測Caspase 3活性變化。 結(jié)果: 1.LDR對K652細(xì)胞周期的影響 (1) K562細(xì)胞多處于S期(%)(55.38±2.22),LDR照射后6h,S期細(xì)胞數(shù)進一步增加(%)(68.29±2.34~74.36±2.23),與對照組相比差異有顯著性;12h及24h時,8cGy、50cGy、80cGy三個劑量點出現(xiàn)G2/M期阻滯,24hG2/M期(%)達高峰(26.61±7

7、.82~29.02±2.76),與對照組相比差異有顯著性;但48h、72h后,各劑量點的細(xì)胞又返回到G0/G1其(%)(36.06±1.90~52.32±2.42),與對照組相比差異有顯著性; (2) 單次大劑量(600cGy)照射后,細(xì)胞多阻滯于S期(%)(76.79±2.13),12h后出現(xiàn)G2/M期阻滯,24h達到高峰(%)(65.21±2.05),與對照組相比差異均有顯著性; (3) 當(dāng)LDR聯(lián)合HDR照射后,未

8、出現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象,G2/M期阻滯現(xiàn)象提前到6h,12h~24h達到高峰(56.27±1.57~69.31±2.51);50cGy+600cGy與80cGy+600cGy兩照射組在6h就出現(xiàn)較高的G2/M期(%)阻滯(分別為35.65±2.05、33.48±1.84),與對照組及HDR組相比差異均有顯著性,12h達到高峰。 2.LDR對K652凋亡的影響:LDR組隨單次照射劑量的增加,K562細(xì)胞受照48h后凋亡率明顯增加,96h

9、達峰值,以50cGy、80cGy劑量組促凋亡作用最強(分別為6.28±0.30與6.47±0.37);LDR+HDR組細(xì)胞凋亡率24h開始增加,96-120h達峰值(27.91±1.07~29.27±0.93),凋亡率最高且持續(xù)時間較長。 3.LDR對K562 Bcl-xl、Bax、p53蛋白表達量的影響:Western Blotting結(jié)果顯示: (1) Bcl-xl的表達量隨LDR照射劑量的增加而逐漸減少,50cGy

10、、80cGy照射后Bcl-xl蛋白表達量相對含量分別為2.65±0.30、2.07±0.31,與20cGy(3.44±0.18)及對照組(3.96±0.08)相比籌異有統(tǒng)計學(xué)意義;當(dāng)HDR與LDR聯(lián)合照射后,聯(lián)合組各劑量點Bcl-xl的蛋白表達量進一步下降,明顯低于LDR組及HDR組; (2) Bax的表達量隨LDR照射劑量的增加而增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,聯(lián)合組Bax蛋白的表達量進一步增加,明顯高于LDR組及HDR組

11、; (3)P53蛋白的表達在LDR或LDR聯(lián)合HDR照射24h時無明顯的變化,與對照組及各組間相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 4.LDR對K562線粒體膜電位(△ψm)的影響:JC-1探針檢測線粒體膜電位MMP(△ψm)的結(jié)果顯示,隨LDR照射劑黽的增加,F(xiàn)L2(紅光)/FL1(綠光)比值呈下降趨勢;當(dāng)LDR聯(lián)合HDR照射后,變化趨勢更加明顯,組間及組內(nèi)比較差異主要存在于50cGy、80cGy、50cGy+600 cGy、80

12、cGy+600 cGy四個照射組,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)差異。 5.LDR對K562 Caspase-3活性的影響:LDR照射24h后Caspase-3活性有逐漸增強的趨勢,與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但LDR各劑量組之間籌異無統(tǒng)計學(xué)意義;當(dāng)LDR與600cGy聯(lián)合照射后,Caspase-3活性有進一步增強的趨勢,50cGy+600cGy、80cGy+600cGy照射后Caspase 3的活性(A405nmOD值)分別為0.

13、28±0.02、0.32±0.04,與600cGy(0.25±0.03)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1.LDR能改變K562細(xì)胞周期進程并能誘導(dǎo)其凋亡,低劑量聯(lián)合大劑量照射可增強大劑量照射對K562的殺傷作用。 2.LDR誘導(dǎo)凋亡機制:改變細(xì)胞周期進程(S/M解偶聯(lián)與G2/M阻滯)及超敏感性,調(diào)控Bcl-2家族表達(下調(diào)Bcl-xl 與上調(diào)Bax),改變線粒體膜通透性,激活Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)而啟動凋亡

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