CTGF基因在食管癌中的表達及與患者預(yù)后關(guān)系的研究.pdf

1、食管癌(esophageal cancer,EC)是一種常見的消化道惡性腫瘤,位于全球腫瘤發(fā)病率的第8位,死亡率的第6位。我國食管癌的死亡率居世界首位,雖然近年來食管癌的死亡率有所下降,但下降并不明顯,在一些食管癌的高發(fā)區(qū),其發(fā)病率和死亡率仍然維持較高水平。因早期癥狀不是很明顯,大部分就診時已是中晚期食管癌患者,進行手術(shù)切除治療的5年生存率僅為25％左右,在全部就診的患者中,5年生存率不足10％。但是,如果早期發(fā)現(xiàn),食管癌手術(shù)切除治療后

2、的5年生存率可達約90％以上,10年生存率可達約73％。探討食管癌的發(fā)病機制,以實現(xiàn)食管癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療已經(jīng)成為目前臨床和基礎(chǔ)研究的主要方向之一。但是,迄今為止,食管癌的病因和發(fā)病機制仍然不明確,所以,有關(guān)食管癌的研究仍然很嚴峻。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及各種分子生物學(xué)技術(shù)的的完善和成熟,PCR以及免疫組織化染色法等技術(shù)已比較成熟,從而為從分子水平上研究食管癌提供了良好的條件。CTGF(Connective Tissue Gro

3、wthFactor)是由早期即刻基因編碼的高度保守的CCN(CTGF、Cef10/cyr61和Nov的縮寫)多肽家族成員之一,CTGF在血管發(fā)生和腫瘤生長中發(fā)揮著不同的作用。
　　近年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CTGF與多種組織器官纖維化有著密切的關(guān)系,即CTGF的表達水平與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲潛能、腫瘤血管生成及其預(yù)后有著密切關(guān)系。從目前文獻報道看,在不同類型的腫瘤,如喉鱗狀細胞癌、甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等CTGF

4、的表達并不一致(有的高表達,有的低表達),CTGF和腫瘤生長的關(guān)系尚無定論。
　　本課題采用實時熒光定量PCR技術(shù)和免疫組化方法分析CTGF基因在食管癌原發(fā)灶及匹配正常食管組織中的mRNA和蛋白水平的表達及與相關(guān)因素的關(guān)系,并且對患者進行了術(shù)后隨訪,研究了CTGF基因的表達對患者預(yù)后的影響。
　　材料與方法：1、研究對象的選擇、組織樣本的采集與患者臨床資料的收集研究對象為2004年至2007年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和河南省林

5、州市腫瘤醫(yī)院住院的食管癌患者。手術(shù)后采集患者的標本,包括食管癌原發(fā)灶及其匹配的正常食管組織,共186對。這些采集到的食管癌樣本均通過免疫組化病理切片的手段鑒定正常組織和腫瘤組織,組織標本經(jīng)外科手術(shù)切除后立即放入液氮中,然后放在-80℃冰箱中冷凍保存。臨床資料包括性別、年齡、家族史、腫瘤的大小、腫瘤分化程度、腫瘤位置以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。2、采用Triozl試劑提取食管癌患者組織標本RNA。通過測定RNA的OD值評估RNA含量和純度。3

6、、使用Pormega公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR擴增β-actin檢測逆轉(zhuǎn)錄效果。4、樣品中CTGFmRNA水平的測定食管癌患者癌組織及匹配的正常組織中CTGF基因mRNA的表達水平采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定。模板mRNA的含量通過測定樣品中目的基因模板的循環(huán)閾值即Ct值來反映。5、樣品中CTGF蛋白水平的測定186例食管癌患者癌組織及其匹配正常組織中CTGF基因蛋白的表達水平通過免疫組織化學(xué)的方法測定

7、。在200倍的顯微鏡下觀察每一個樣品標本3個染色最強的視野,同時計數(shù)陽性細胞數(shù),并計算陽性細胞百分比。食管癌蛋白表達水平的指標采用每個患者的食管癌組織中陽性細胞百分比與正常食管組織中陽性細胞百分比的比值來表示。6、生存分析2008年3-4月期間,對2004年至2007年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和林州市腫瘤醫(yī)院就醫(yī)并采集到標本的食管癌患者進行隨訪?；颊呤中g(shù)治療的時間作為生存的起始時間,隨訪結(jié)束的時間作為生存的終止時間,終止時間與起始時間之間

8、的時間間隔作為患者的生存時間。7、統(tǒng)計學(xué)分析運用統(tǒng)計分析軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。對于每一個樣本,用ΔCt(CtCTGF-Ctβ-actin)值表示目的基因與內(nèi)參基因β-actin間Ct的差值,Δ(ΔCt)值等于ΔCt(正常食管組織)—ΔCt(食管癌組織)。對Δ(ΔCt)和蛋白的表達水平采用獨立樣本t檢驗。不同相關(guān)因素間食管癌樣本CTGF基因mRNA和蛋白的表達水平差異比較采用χ2檢驗。繪出CTGF基因表達陽性與陰性

9、的患者Kaplan-Meier生存曲線,兩條曲線的差異采用Log-rank(時序檢驗)來比較。采用Cox回歸(比例危險率回歸模型)分析相關(guān)因素與基因表達對生存時間的影響。以α=0.05作為檢驗水準。
　　結(jié)果：1、CTGFmRNA水平與食管癌的關(guān)系1.1 CTGF基因在食管癌組織中和匹配的正常食管組織中的mRNA表達水平實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,在186例樣品中,與匹配正常食管組織相比,CTGF在82.8％(154/186)的食

10、管癌組織中的表達上調(diào)。食管癌組織和正常食管組織中CTGF基因mRNA的表達水平差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。1.2 CTGFmRNA在食管癌組織中的表達與相關(guān)因素之間的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有家族史組CTGF mRNA表達水平顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組和無家族史組(P=0.000,P=0.001)。CTGF mRNA在不同腫瘤體積間、不同的浸潤深度間、不同的腫瘤分化程度間表達水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000,P=0.000

11、,P=0.000)。而CTGFmRNA的表達水平與其他一些因素(性別、年齡、腫瘤病理形態(tài)類型、腫瘤位置)無關(guān)。2、CTGF蛋白水平與食管癌的關(guān)系2.1 CTGF基因在食管癌組織中與正常食管組織中蛋白水平的表達配對t檢驗結(jié)果顯示,CTGF基因在食管癌組織中蛋白的表達水平顯著高于其匹配的正常食管癌組織(P=0.000),與real-time PCR結(jié)果相一致。2.2 CTGF蛋白在食管癌組織中的表達與相關(guān)因素之間的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有家族史

12、組的CTGF蛋白表達水平顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組和無家族史組(P=0.000,P=0.000)。CTGF蛋白在不同腫瘤體積間、不同的浸潤深度間、不同的腫瘤分化程度間的表達水平差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。而CTGF蛋白的表達水平與其他一些因素(性別、年齡、腫瘤病理形態(tài)類型、腫瘤位置)無關(guān)。與CTGFmRNA表達水平的結(jié)果一致。3、生存分析：3.1食管癌患者單因素生存分析單變量生存分析結(jié)果表明,

13、CTGF的mRNA表達、蛋白表達、性別、家族史、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度與食管癌患者的生存時間顯著相關(guān)。CTGFmRNA和蛋白高表達患者的生存時間顯著低于CTGF低表達患者的生存時間(P=0.000,P=0.000)。同樣,有腫瘤家族史和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的生存時間顯著低于無家族史和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者的生存時間(P=0.0017,P=0.000),浸潤深度與生存時間也存在顯著相關(guān)(P=0.0012),浸潤到粘膜層生存率比淺

14、肌層高。腫瘤分化程度、性別和腫瘤大小與患者生存時間也存在顯著相關(guān)(P=0.001,P=0.0104,P=0.0381),低分化生存時間最低,高分化生存時間最高,男性比女性生存時間長,腫瘤體積越大生存時間越低。年齡、病理形態(tài)類型和腫瘤位置與病人的生存時間無相關(guān)性。3.2食管癌COX多因素回歸分析多因素生存分析(COX回歸分析)結(jié)果表明,影響食管癌患者生存時間的獨立危險因素是CTGFmRNA表達、蛋白表達、家族史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度,

15、相對危險度分別是5.008(95％CI1.562~16.057)、1.567(95％CI1.171~2.681)、1.65(95％CI1.037~2.641)、2.247(95％CI1.309~3.860)、1.507(95％CI1.104~2.056)。未發(fā)現(xiàn)年齡、腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤病理形態(tài)類型、腫瘤位置與食管癌患者的生存時間有相關(guān)性。
　　結(jié)論：1、食管癌組織CTGFmRNA表達水平顯著高于其匹配正常食管組織的CTGFm

16、RNA表達水平。CTGFmRNA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、家族史、腫瘤體積、浸潤深度和腫瘤分化程度相關(guān)。2、CTGF蛋白在食管癌組織中的表達水平顯著高于匹配正常食管組織中的表達水平。CTGF蛋白表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、家族史、腫瘤體積、浸潤深度和腫瘤分化程度相關(guān)。3、食管癌患者CTGF高表達的平均生存時間顯著低于CTGF低表達的患者平均生存時間。影響食管癌患者生存時間的獨立危險因素是CTGFmRNA表達、CTGF蛋白表達、家族史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和