子癇前期與HLA-G相關的發(fā)病機制及其子代大腦發(fā)育和功能的研究.pdf

1、子癇前期是人類妊娠期特有的多系統(tǒng)、多器官損傷的疾病。該病在孕婦中的發(fā)生率大概為3-5％，發(fā)展中國家比例更高。經(jīng)典的子癇前期是以妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓，尿蛋白等癥狀為主要特征。該疾病已經(jīng)成為主要危害了母嬰健康甚至引起死亡的妊娠期疾病。目前的研究表明，胎盤著床不足是子癇前期疾病發(fā)生的重要特征。而滋養(yǎng)層細胞侵襲不足是導致胎盤淺著床的一個重要原因。滋養(yǎng)層細胞是胚胎與母體直接接觸的部分，包括細胞滋養(yǎng)層細胞、合體滋養(yǎng)層細胞和絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞三

2、個亞群。滋養(yǎng)層細胞侵入母體蛻膜層不被母體排斥而快速增殖是妊娠成功的關鍵因素之一。以往的研究已經(jīng)表明表達在滋養(yǎng)層細胞中的人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)在胚胎成功著床過程中扮演著重要的角色。滋養(yǎng)層細胞中HLA-G表達下降會導致多種妊娠期疾病包括子癇前期。HLA-G基因是非經(jīng)典的主要組織相容性復合物(major histocompatibilitycomplex，MHC)Ⅰ類分子。現(xiàn)在已知，

3、HLA-G可以通過多種機制誘導母胎間免疫耐受，尤其是對母胎界面中的免疫活性細胞如NK細胞、T細胞、抗原提呈細胞等的調節(jié)作用，從而使胚胎免遭受蛻膜NK細胞和T淋巴細胞的攻擊。但是我們依然不清楚HLA-G是否可以不依賴于免疫調節(jié)作用單獨作用于滋養(yǎng)層細胞的生物學行為以及其調控機理。這些將有助于我們深入了解子癇前期發(fā)病機理，有助于我們對該疾病的預防和治療。所以，在本論文的第一部分，我們通過調節(jié)在JEG-3細胞中HLA-G的表達來研究其功能及其機

4、制。
　　然而，目前的研究仍無法提供有效的治療和預防子癇前期疾病發(fā)生的措施。子癇前期作為人類孕期特有的疾病，不僅影響母親的身體健康也嚴重的影響了其子代的發(fā)展。流行性病學調查研究表明子癇前期患者的子代在其成年后易發(fā)生發(fā)育性呼吸窘迫綜合癥，高血壓，中風等疾病。所以有必要建立子癇前期疾病的動物模型以有利于進一步理解子癇前期的發(fā)病機理和其對子代的影響。之前的研究表明對動物進行N∞硝基L精氨酸甲酯(Nω-Nitro-L-Arginine M

5、ethyEster, L-NAME)處理（一種一氧化氮合成抑制劑）可以導致子癇前期樣特征的產(chǎn)生。之前的研究主要集中在子癇前期子代的肺、腎臟、血管內(nèi)皮細胞發(fā)育和功能的研究。而子癇前期發(fā)病的時間恰是胚胎大腦發(fā)育的關鍵時期。在本論文的第二部分中，我們使用了妊娠14.5天的Sprague-Dawley大鼠來闡明子癇前期樣大鼠模型中子代鼠大腦發(fā)育及功能變化及其可能的機制。
　　第一部分 HLA-G調控JEG-3侵襲力的細胞信號通路的研究

6、r>　　目的:通過上調和下調HLA-G在JEG-3細胞中的表達，研究其不依賴于與免疫細胞相互作用，在調節(jié)JEG-3細胞生物學行為中的功能及其分子機制。
　　方法:用轉染HLA-G特異性siRNA來下調HLA-G的表達。用外加humangalectin-1的方法上調HLA-G的表達。用transwell的方法觀察上調和下調HLA-G表達后，JEG-3細胞的侵襲力。用Brdu急性摻入法及PH3標記法觀察下調HLA-G表達后JEG-3細

7、胞的增殖情況，activated cleaveage caspase3標記法觀察下調HLA-G表達后JEG-3細胞的凋亡情況。用Western blot的方法研究HLA-G被上調和下調后STAT3磷酸化程度的變化。外加白介素6(interleukin-6，IL-6)來研究其能否恢復HLA-G被下調后STAT3磷酸化程度和JEG-3細胞的侵襲力。
　　結果:1）在HLA-G表達下調后，JEG-3細胞的增殖凋亡沒有發(fā)生明顯變化但是其侵

8、襲能力明顯下降。2）下調HLA-G表達后，信號傳導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)的磷酸化程度明顯下降。3）使用人類凝集素1(human galectin-1)處理JEG-3細胞可以上調HLA-G表達，促進STAT3的活化，并且增加JEG-3細胞侵襲能力。4）發(fā)現(xiàn)IL-6，但不是humangalectin-1可以通過提高STAT3磷酸化程度來

9、恢復HLA-G下調后引起的侵襲力下降。
　　結論:這一結果揭示了STAT3磷酸化程度是HLA-G直接調節(jié)JEG-3細胞的侵襲力的關鍵生物學事件。這是HLA-G低表達導致子癇前期發(fā)生的原因。
　　第二部分 子癇前期樣大鼠子代大腦發(fā)育和功能的研究
　　目的:構建子癇前期樣大鼠模型，并研究子癇前期樣的大鼠子代大腦發(fā)育和功能是否受到影響及其細胞和分子機制。
　　方法:把妊娠的母鼠隨機分成兩組。實驗組從妊娠14.5天到21

10、天喂食含50mg·kg-1·d-1L-NAME的水，對照組喂食清水。用血壓和尿蛋白測定來確定模型的建立。用免疫組化方法來研究P0仔鼠大腦發(fā)育狀況。用水迷宮實驗來研究8周齡雄性子代鼠的空間學習記憶能力。用免疫組化的方法來研究8周齡雄性子代鼠大腦的結構及發(fā)育情況。用realtime PCR的方法檢測神經(jīng)元生成相關基因的表達情況。并用BSP方法檢測相關基因的甲基化狀態(tài)。用Western blot的方法檢測了學習記憶LTP相關蛋白的表達狀況。<

11、br>　　結果:1）成功構建子癇前期樣大鼠模型。2）發(fā)現(xiàn)子癇前期樣大鼠子代P0仔鼠體重和腦重比正常的大鼠子代的小，但腦-體重比沒有明顯的變化。3）P0仔鼠皮層的放射狀膠質細胞形態(tài)、分化、凋亡情況沒有明顯的變化，但神經(jīng)細胞發(fā)生層的增殖能力明顯的下降，增殖相關的基因(Fgf2，Creb和Ep300)也有明顯下調。4）發(fā)現(xiàn)8周齡子癇前期樣大鼠子代的大腦皮層板層結構和皮層厚度沒有明顯變化，并且腦重和體重都明顯的回復到正常組大鼠子代的水平。5）發(fā)

12、現(xiàn)8周齡的子癇前期樣大鼠子代的空間學習和記憶能力低于正常組。6）分析學習記憶相關的細胞和分子機理，初步發(fā)現(xiàn)在子癇前期樣大鼠子代的膠質細胞有顯著增生，并且成年海馬新生神經(jīng)元的生成能力變?nèi)?，增殖相關的基因表達（Fgf2）有顯著性變化。7）發(fā)現(xiàn)Fgf2，Creb和Ep300基因啟動子區(qū)甲基化程度無變化。8）發(fā)現(xiàn)LTP相關蛋白ERK，JNK在表達和磷酸化水平都無變化。
　　結論:我們的結果表明子癇前期樣大鼠子代的大腦發(fā)育和功能受到明顯的影