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文檔簡介
1、妊娠高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy)HDCP是指妊娠20周后出現(xiàn)的特發(fā)性高血壓綜合征,其病理、生理變化涉及全身各系統(tǒng),包括妊娠期高血壓、子癇前期(Preeclampsia)、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期以及妊娠合并慢性高血壓共五種類型。發(fā)生率在我國為9.4%~10.4%,國外為7%~12%,是孕產(chǎn)婦和圍生兒病死率增加的主要因為,嚴(yán)重影響母兒安全。
重度子
2、癇前期(Severe pre-eclampsia)是妊娠期高血壓疾病的一種常見類型和重要的發(fā)病階段,患者出現(xiàn)一過性的高血壓、水腫、蛋白尿,其特征性病理變化是子宮螺旋小動脈生理性重鑄障礙和內(nèi)皮細(xì)胞損傷。關(guān)于重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制存在很多學(xué)說卻無統(tǒng)一定論,主要包括:免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說、異常滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮肌層、血管內(nèi)皮受損、營養(yǎng)缺乏和胰島素抵抗。其中免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說相互影響、相互滲透,逐漸形成了免疫遺傳學(xué)說,成為子癇前期機(jī)制研究領(lǐng)域中最
3、活躍的部分。
免疫遺傳的核心為組織相容,人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)作為病因?qū)W上一個重要的免疫遺傳因子,是引發(fā)同種移植排斥反應(yīng)的主要抗原,現(xiàn)多數(shù)學(xué)者認(rèn)為攜帶父源性基因的胎兒對母體而言是一種同種半異體移植物。正常情況下,母、胎間存在免疫耐受,可保證母胎和平共處。在子癇前期狀態(tài)下該免疫耐受被打破,可導(dǎo)致一系列類似于急性移植排斥反應(yīng)的病理學(xué)改變,而胎兒一經(jīng)娩出,則患者癥狀即可逆轉(zhuǎn)。據(jù)此
4、推測,妊娠是一種特殊的生理狀態(tài),無論正?;虍惓?均是母胎雙方共同作用的結(jié)果。故致病基因既可能來自母體,也可能來自胎兒,或由母胎雙方基因相互作用而致病。
人白細(xì)胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G)是一種非經(jīng)典的HLA-GⅠ b類抗原,主要表達(dá)于母胎界面絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillouscytotrophoblast,EVCT)上。這種嚴(yán)格的組織學(xué)分布及其在妊娠免疫耐受中所起的
5、重要作用特別引人矚目。作為免疫耐受分子之一,它可通過多種機(jī)制參與機(jī)體免疫耐受的誘導(dǎo)與維持,參與病理妊娠的發(fā)生與發(fā)展,是研究HLA與子癇前期發(fā)病機(jī)制中最為關(guān)鍵的一部分。
包括本課題組在內(nèi)的以往大量研究表明:子癇前期孕婦胎盤HLA-G mRNA和HLA-G蛋白表達(dá)異?;蚪档?。當(dāng)HLA-G表達(dá)缺陷時,可能導(dǎo)致母胎界面的免疫排斥反應(yīng)增強,保護(hù)性反應(yīng)減弱,滋養(yǎng)細(xì)胞侵入能力受損,導(dǎo)致胎盤淺著床,胎盤供流不足,最終引發(fā)子癇前期。近年來的
6、研究發(fā)現(xiàn),HLA-G基因多態(tài)性的存在可能是導(dǎo)致這一級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因為。HLA基因的高度多態(tài)性導(dǎo)致了個體間免疫應(yīng)答能力的不同和對疾病易感性出現(xiàn)差異?,F(xiàn)在許多與HLA相關(guān)的疾病都需要以基因分型技術(shù)來重新研究,以便把易感基因定位于分子水平,為基因治療奠定基礎(chǔ)。
HLA-G基因多態(tài)性包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)的多態(tài)性。其中編碼區(qū)的多態(tài)性有限,多是無意義的突變和缺失,該核苷酸序列的變化不引起氨基酸種類的改變,不改變蛋白的數(shù)量和功能,最新研
7、究發(fā)現(xiàn)HLA-G3’-非翻譯區(qū)(3-untranslatedregion,3’-UTR)第8外顯子(8th Exon,Exon8)中的14bp缺失/插入位點多態(tài)性影響HLA-G的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),與病理妊娠密切相關(guān)。關(guān)于此多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的易感性已被證實,但與重度子癇前期的關(guān)系尚未明確,需要做進(jìn)一步的研究。越來越多的研究表明妊娠期母體免疫系統(tǒng)對胚胎移植抗原的免疫耐受的形成不僅僅是妊娠期母體免疫系統(tǒng)的功能被抑制,而是母胎間免疫調(diào)節(jié)達(dá)到平衡狀態(tài)
8、的結(jié)果。國內(nèi)外許多研究也均證實單從母親一方面考慮HLA-G基因多態(tài)性與重度子癇前期的關(guān)系是不全面的,這種特殊的妊娠狀態(tài)可能是由于母胎雙方基因相互作用所致。并且此多態(tài)性的分布會因地域、種族和人種的不同而存在差異,尚需做進(jìn)一步的探討。
目的
本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR),對河南地區(qū)漢族婦女中42對重度子癇前期孕婦及其新生兒和45對正常晚孕者孕婦及其新生兒,進(jìn)行HLA-G基因第8外顯子14bp缺失多態(tài)性的等
9、位基因分型,分別比較兩組孕婦之間和兩組新生兒之間等位基因及基因型的頻率分布,通過母/兒基因型配伍,比較兩組間基因型配伍頻率分布的差異。進(jìn)而來研究河南地區(qū)漢族婦女重度子癇前期與此多態(tài)性的關(guān)系,為進(jìn)一步探討重度子癇前期的發(fā)病機(jī)制提供重要線索,也為臨床上利用母胎間信息預(yù)測子癇前期的發(fā)病風(fēng)險提供實驗證據(jù)。
材料與方法
1研究對象
選擇2008年10月至2009年2月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院,經(jīng)臨床
10、確診的42對重度子癇前期孕婦及其新生兒為病例組。診斷標(biāo)準(zhǔn)按人民衛(wèi)生出版社第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》[1],并排除內(nèi)分泌疾病、慢性高血壓病、腎臟疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥等,且所有患者均隨訪至產(chǎn)后12周?;颊咂骄挲g(30.60±5.76)歲,平均孕周為(35.95±3.22)周。另選擇同期的正常晚孕的孕婦及其新生兒45對為對照組,平均年齡(30.09±4.80)歲,平均孕周為(36.52±1.56)周。兩組孕婦均為河南地區(qū)居民、漢族、無異族通婚史
11、、無血緣關(guān)系,并且孕婦年齡、孕周及孕產(chǎn)次比較,均無顯著性差異(P>0.05)。
2方法
2.1標(biāo)本采集
分別抽取重度子癇前期和正常晚孕組孕婦外周靜脈血2ml,同時于兩組孕婦分娩時無菌抽取臍靜脈血2ml,母、臍血均采用枸櫞酸鈉抗凝,-20℃冰箱凍存待檢。
2.2鹽析法提取基因組DNA提取
取冰凍全血室溫解凍,裂解紅細(xì)胞后在離心沉淀的白細(xì)胞中加入白細(xì)胞裂解液震蕩懸浮,55
12、℃水浴30min,冷卻至室溫,飽和氯化鈉鹽析后取上清液加入750μL無水乙醇充分顛倒混勻后,見絮狀析出,70%乙醇500μL洗滌,室溫至干,溶于三蒸水中,用紫外分光光度計測量其含量及純度。調(diào)節(jié)DNA濃度至100ng/μl左右,-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.3 HLA-G基因分型
2.3.1引物設(shè)計
根據(jù)PCR法進(jìn)行設(shè)計,由上海英駿生物公司合成。
Exon8部分片段:
上游:
13、5’-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3’
下游:5’-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3’
β-actin:
上游:5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’
下游:5'-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’
2.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
采用25μl反應(yīng)體系,包含10×Taqbuffe
14、r緩沖液2.5μl;2mM dNTPMix2.5μl;5μM HLA-G引物2μl;5μM內(nèi)對照引物2μl;2.5U/LTaq DNA聚合酶0.5U;25mM MgCl21.5μl;基因組DNA1μl;三蒸水13μl。96孔PCR反應(yīng)板加蓋石蠟油。
2.3.3 PCR反應(yīng)條件
94℃預(yù)變性為5min,94℃30s,64℃1min,72℃2min,共循環(huán)35次,最后72℃延伸10 min。
2.4
15、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳
取5μl PCR產(chǎn)物直接加入含有0.5μg/ml0.5×1000 Gelred核酸染色劑的3.5%瓊脂糖凝膠電泳槽,100V電泳45min,于凝膠圖象分析系統(tǒng)觀察,拍照。根據(jù)14bp缺失多態(tài)性的不同,HLA-G基因的Exon8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果有三種,分別判讀為:擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶,長度為210bp,可判讀為缺失純合子(-14bp/-14bp);擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶,長度為224bp,可判讀為插入
16、純合子(+14bp/+14bp):擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶,長度分別為210bp和224bp,可判讀為缺失雜合子(-14bp/+14bp);長度為548bp的是內(nèi)參片段β-actin。
2.5224bp和210bp擴(kuò)增產(chǎn)物測序
選取電泳圖像均為單獨一條帶擴(kuò)增產(chǎn)物,缺失純合子(-14bp/-14bp)和插入純合子(+14bp/+14bp)的PCR反應(yīng)原液,送Invit rogen公司純化并測序。測序結(jié)果與GenBank
17、 Blast比對,與HLA-G Exon8片段相符(GenBank登錄號J52705)。224bp產(chǎn)物比210bp產(chǎn)物多了一段長度為14bp的基因序列:
ATTTGTTCTTGCCT。
3統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,應(yīng)用擬合優(yōu)度x2檢驗判斷基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;兩組間計量資料比較用單因素方差分析;直接計算法計算各組等位基因頻率;等位基因的
18、頻率分布差異采用四格表法進(jìn)行x2檢驗,對不適合x2檢驗條件的數(shù)據(jù)用Fisher精確概率法計算P值。當(dāng)兩組間等位基因、基因型頻率或者基因型配伍具有顯著差異(P<0.05)時,進(jìn)一步計算其關(guān)聯(lián)強度比值比(OR值)及95%可信區(qū)間(CI)。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
結(jié)果:
1兩組孕婦臨床一般資料比較
分析重度子癇前期組和正常晚孕組孕婦臨床資料,進(jìn)行比較可知兩組孕婦在年齡、分娩孕周上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意
19、義(P>0.05);
2 HLA-G基因14bp缺失多態(tài)性分析
重度子癇前期組和正常晚孕組孕婦及其新生兒的HLA-G基因14bp缺失多態(tài)性的基因型頻率分布,均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),該群體基因符合遺傳平衡;
2.1兩組孕婦HLA-G14bp缺失多態(tài)性的等位基因、基因型頻率比較
重度子癇前期組孕婦HLA-G14bp缺失多態(tài)性等位基因頻率:+14bp為
20、34.5%、-14bp為65.5%,正常晚孕組依次為26.7%、73.3%,兩組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=1.266 P=0.260);兩組孕婦間基因型比較:重度子癇前期組中缺失純合子(-14bp/-14bp)、缺失雜合子(-14bp/+14bp)、插入純合子(+14bp/+14bp)基因型的分布頻率依次為42.9%、45.2%、11.9%,正常晚孕組中的頻率依次為51.1%、44.4%、4.4%,各基因型分布頻率進(jìn)行比較,差異均不
21、具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);
2.2兩組新生兒HLA-G14bp缺失多態(tài)性的等位基因、基因型分布頻率比較
重度子癇前期組新生兒HLA-G14bp缺失多態(tài)性等位基因頻率:+14bp為44.4%、-14bp為56.0%,正常晚孕組依次為30.0%、70.0%,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=3.678 P=0.055);兩組新生兒間基因型比較:重度子癇前期組中缺失純合子(-14bp/-14bp)、缺失雜合子(
22、-14bp/+14bp)、插入純合子(+14bp/+14bp)基因型的分布頻率依次為28.5%、54.8%、16.7%,正常晚孕組中的頻率依次為48.9%、45.2%、8.9%,各基因型分布頻率進(jìn)行比較,差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);
2.3兩組母/兒 HLA-G14bp缺失多態(tài)性的基因型配伍比較
重度子癇前期組中母/兒為缺失純合子(-14bp/-14bp)的基因型配伍的頻率為14.3%,顯著低于正
23、常晚孕組的33.3%,兩組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[x2=4.304,P=0.038;OR=3.000(95%CI1.036-8.690)]。余基因型配伍類型在兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
1中國河南地區(qū)漢族孕婦中,HLA-G基因14bp缺失多態(tài)性與重度子癇前期的易感性之間存在相關(guān)性;
2母/兒為缺失純合子(-14bp/-14bp)基因型配伍時,孕婦發(fā)生重度子癇前期的風(fēng)
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