父源性HLA-A基因與子癇前期相關(guān)性研究.pdf

1、子癇前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病。它是妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders in pregnancy,HIP)的一種類型,發(fā)病率我國為9.4％,國外報(bào)道7％-12％。臨床上以妊娠20周以后出現(xiàn)血壓≥140/90mmHg且尿蛋白≥300mg/24h或(+)為特征,常常累及心、肝、腦、腎等重要器官,造成多臟器功能衰竭。該病嚴(yán)重影響母嬰健康,是孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病及死亡的主要原因之一。但是

2、,其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明,成為當(dāng)前婦產(chǎn)科領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。為此,國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究,對其病因和發(fā)病機(jī)制提出了以下幾種學(xué)說:①免疫學(xué)說；②胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞缺血缺氧學(xué)說；③氧化應(yīng)激學(xué)說；④遺傳學(xué)說。隨著現(xiàn)代生殖免疫學(xué)的發(fā)展,免疫遺傳學(xué)說被廣泛認(rèn)可,成為近幾年研究的熱點(diǎn)。
　　 妊娠可被視為一次成功的同種半異體移植。某些研究發(fā)現(xiàn):子癇前期患者可出現(xiàn)類似于急性器官移植排斥反應(yīng)的急性血管炎等病理改變。同種移植排

3、斥反應(yīng)乃是針對同種異體組織抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答,最重要的組織抗原是由主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)基因編碼的產(chǎn)物,人的MHC稱為人類白細(xì)胞分化抗原(human leucocyte antigen,HLA),編碼基因位于人類6號染色體P21.31,全長3600kb,占人類整個(gè)基因組的1/3000,是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)的最具多態(tài)性的基因復(fù)合體。該復(fù)合體不僅含有多個(gè)基因座位(lo

4、cus),而且同一HLA基因座位具有多個(gè)等位基因(allele),各等位基因的頻率具有人種、民族和地域的差異。
　　 HLA基因可分為3類:①經(jīng)典HLA基因,包括經(jīng)典的HLA-Ⅰ類基因(HLA-A、-B、-C)和經(jīng)典的HLA-Ⅱ類基因(HLA-DR、-DP、-DQ)；②免疫功能相關(guān)基因,包括血清補(bǔ)體成分(C2、C4、B因子)編碼基因、抗原加工提成相關(guān)基因:如抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)物(transporter associated with a

5、ntigen processing,TAP)、巨大多功能蛋白酶體(large multifunctional proteasome,LMP)、HLA-DM、HLA-DO等以及非經(jīng)典HLA-Ⅰ類基因(如HLA-E、-F、-G等)和炎癥相關(guān)基因(腫瘤壞死因子家族等)；③免疫無關(guān)基因,包括21羥化酶(CYP21)基因等。
　　 HLA-A基因?qū)儆诮?jīng)典的HLA-Ⅰ類基因,其基因位點(diǎn)顯示多態(tài)性,廣泛分布于全身有核細(xì)胞表面,是參與抗原提呈的

6、關(guān)鍵分子,也是引發(fā)同種移植排斥反應(yīng)的主要抗原,它將內(nèi)源性的多肽呈遞給CD8+毒性T細(xì)胞,與特異性的免疫應(yīng)答尤其相關(guān)。
　　 HLA復(fù)合體是緊密連鎖的,這些連鎖在一條染色體上的等位基因很少發(fā)生同源染色體間的交換。在遺傳過程中,HLA單倍型作為一個(gè)完整的遺傳單位由親代傳給子代。而人是雙倍體動(dòng)物,任何一個(gè)個(gè)體所攜帶的兩個(gè)HLA等位基因必定分別來自父方和母方。帶有父方異體抗原成分的胚胎對母體來說是一個(gè)移植物,母體免疫系統(tǒng)對此進(jìn)行識別,并

7、產(chǎn)生免疫應(yīng)答。正常妊娠時(shí),母體對胎兒形成免疫耐受,對胎兒起保護(hù)作用的應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng),對胎兒起排斥作用的應(yīng)答反應(yīng)降低。一旦父方抗原發(fā)生改變,那么母體產(chǎn)生的具有封閉效應(yīng)的特異性很強(qiáng)的抗體便失去了保護(hù)作用,攜帶一半父方基因的胎兒就易被母體排斥,從而產(chǎn)生諸如子癇前期之類的免疫性疾病,由此提示:父源性基因可能在子癇前期的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　 目的
　　 本課題在河南省鄭州地區(qū)漢族子癇前期患者及其配偶和正常晚孕孕婦及其配偶中采集

8、血液樣本,借助PCR-SSP技術(shù)進(jìn)行HLA-A等位基因分型,探索父源性HLA-A基因與子癇前期的相關(guān)性,以闡明父方免疫遺傳學(xué)背景與子癇前期發(fā)病的關(guān)系,并為預(yù)測子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、對高危人群進(jìn)行早期干預(yù)等提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 1研究對象
　　 選擇2008年10月至2009年3月河南省鄭州地區(qū)在我院經(jīng)臨床確診的子癇前期患者及其配偶53對。按照高等醫(yī)學(xué)院校規(guī)劃教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第七版的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診

9、病例。孕婦平均年齡為(30.49±5.03)歲,平均孕周為(35.98±3.04)周。隨機(jī)選擇同期在我院產(chǎn)科住院待娩的正常健康孕婦及其配偶51對為對照組。孕婦平均年齡為(29.97±4.80)歲,平均孕周為(37.45±1.51)周。兩組孕婦均無原發(fā)性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝病病史,無輸血及骨髓移植史,無免疫治療史。兩組孕婦均為漢族,無血緣關(guān)系,無異族通婚史。所有研究對象均簽署了知情同意書。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法
　　

10、 2.1標(biāo)本采集
　　 于無菌操作下分別采集53對子癇前期組孕婦及其配偶和51對正常晚孕組孕婦及其配偶外周靜脈血2ml,以3.8％枸櫞酸鈉抗凝,分組編號后,置-20℃冰箱凍存待檢。
　　 2.2基因組DNA提取
　　 采用鹽析法。取冰凍全血室溫解凍,裂解紅細(xì)胞后在離心沉淀的白細(xì)胞中加入白細(xì)胞裂解液,混勻,55℃水浴30min,冷卻至室溫,經(jīng)飽和氯化鈉鹽析后加無水乙醇充分顛倒混勻,見絮狀析出,離心,取上清液加入7

11、0％的乙醇,洗滌,離心棄上清,室溫至干,加無菌三蒸水溶解,用紫外分光光度儀測其含量及純度。調(diào)整DNA濃度至100ng/μl,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.3 HLA-A基因分型
　　 采用PCR-SSP法。根據(jù)1995年公布的HLA-Ⅰ類核苷酸序列,按Bunce等的方法設(shè)計(jì)24對HLA-A特異性引物。另外設(shè)計(jì)一對內(nèi)參照引物,來檢測反應(yīng)體系是否正常進(jìn)行,內(nèi)參照引物序列上游為5’-FGC CAA GTG GAG CAC CC

12、A A-3’；下游為5’-GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT-3’。所有引物由上海英駿生物公司合成。PCR的反應(yīng)體系為25μl,包含基因組DNA1μ1、10×buffer緩沖液2.5μl、Mg2+1.5μl、2mM的dNTP2.5μl、5μM的HLA-A引物2μl、5μM內(nèi)對照引物2μl、Taq DNA聚合酶0.7U、無菌三蒸水12.8μl。PCR的擴(kuò)增條件如下:96℃5min；96℃30s,64℃50s,72℃50s

13、,循環(huán)5次；96℃30s,62℃50s,72℃50s,循環(huán)5次；96℃30s,60℃50s,72℃50s,循環(huán)10次；96℃30s,55℃50s,72℃50s,循環(huán)15次；最后72℃延伸10min。取6μl PCR產(chǎn)物直接加入2％的瓊脂糖泳槽中,設(shè)定電壓140V,電流90mA,電泳20min,紫外凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間計(jì)量資料比較采用單因

14、素方差分析,采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因頻率,兩組間等位基因分布的差異采用四格表法進(jìn)行x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法計(jì)算P值,有顯著性差異時(shí)計(jì)算疾病優(yōu)勢比(oddsratio,OR)及95％可信區(qū)間(confidenceinterval,C1),OR值越大,表明危險(xiǎn)性越大,與疾病的關(guān)聯(lián)越大。對兩組間等位基因頻率較高或兩組間等位基因頻率具有顯著性差異者(P<0.05),分析該基因在夫婦間的配伍情況,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。由于每個(gè)患者的

15、HLA-A位點(diǎn)均有兩個(gè)等位基因,故計(jì)算基因頻率以總基因數(shù)(即患者或?qū)φ杖藬?shù)×2)為分母,以等位基因數(shù)為分子。
　　 結(jié)果：
　　 1正常晚孕組和子癇前期組一般臨床資料的比較
　　 51例正常晚孕組孕婦和53例子癇前期組孕婦的年齡和分娩孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2正常晚孕組和子癇前期組孕婦HLA-A等位基因頻率比較
　　 51例正常晚孕孕婦和53例子癇前期孕婦中共檢出14個(gè)HLA

16、-A等位基因。正常晚孕組孕婦以HLA-A2(19.61％)、-A24(15.69％)、-A11(14.71％)基因頻率最高；子癇前期組孕婦以HLA-A2(26.42％)、-A11(16.04％)、-A24(10.38％)基因頻率最高。兩組孕婦間HLA-A各等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3正常晚孕組和子癇前期組配偶HLA-A等位基因頻率比較
　　 所有受試者配偶共檢出13個(gè)HLA-A等位基因。正常晚孕組配偶中以H

17、LA-A24(18.63％)、-A2(16.67％)、-A11(13.73％)基因頻率最高；子癇前期組配偶中以HLA-A2(20.75％)、-A11(15.09％)、-A24(5.66％)基因頻率最高。子癇前期組配偶HLA-A24基因頻率低于正常晚孕組(P<0.05),OR=3.050,95％CI(1.236-7.690),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其它各HLA-A等位基因頻率在兩組配偶間無明顯差異。
　　 4正常晚孕組和子癇前期組夫

18、婦HLA-A等位基因配伍頻率分析
　　 選擇正常晚孕組和子癇前期組等位基因頻率較高或兩組間比較具有顯著差異(P<0.05)的HLA-A等位基因(HLA-A2、-A11、-A24),分析該基因在夫婦間的配伍情況。子癇前期組夫婦均攜帶HLA-A11基因的頻率顯著高于正常晚孕組(P<0.05)；子癇前期組婦不攜帶而夫攜帶HLA-A24基因的頻率,顯著低于正常晚孕組(P<0.05)；子癇前期組夫婦均不攜帶HLA-A24基因的頻率,顯著高