華中地區(qū)三種畜禽病原菌耐藥和毒力的流行性及分子特征研究.pdf

1、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌都是重要的人畜共患病致病菌和食源性病原菌。它們不僅導(dǎo)致畜禽患病，而且能通過(guò)食物鏈或接觸患病動(dòng)物而傳遞到人?？股厥侵委熁疾?dòng)物的首選，但同時(shí)也產(chǎn)生了耐藥菌。而這些耐藥菌也能通過(guò)動(dòng)物或食物鏈傳遞給人。本研究對(duì)華中地區(qū)三省(河南省、湖北省和湖南省）大型養(yǎng)殖場(chǎng)（豬、雞和奶牛）的三種主要致病菌的耐藥性、耐藥基因、毒力基因和基因型的流行性進(jìn)行調(diào)查研究，不僅提供了相關(guān)的監(jiān)測(cè)信息，也提供臨床使用抗生素提供用藥方案

2、以保護(hù)動(dòng)物健康和食品安全，為進(jìn)一步的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.樣品采集
　　2010年3月-2011年7月從河南省、湖北省和湖南省的大型養(yǎng)殖雞場(chǎng)、豬場(chǎng)和奶牛場(chǎng)采集健康動(dòng)物泄殖腔或肛門拭子樣品2185份，雞場(chǎng)來(lái)源837份，豬場(chǎng)來(lái)源930份，奶牛場(chǎng)來(lái)源418份。每份樣品同時(shí)進(jìn)行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌的培養(yǎng)和分離鑒定。
　　2.華中地區(qū)畜禽沙門氏菌耐藥和毒力的流行性及分子特征研究
　　通過(guò)生化反應(yīng)和i

3、nvA基因的PCR鑒定，共鑒定出248株(11.35％，248/2185)沙門氏菌。雞源、豬源和奶牛源沙門氏菌的分離率分別為12.54％(105/837)、4.09％(38/930)和25.12％(105/418)。從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院得到了209株豬源沙門氏菌。共有457株沙門氏菌參與了血清型鑒定試驗(yàn)，抗生素敏感性試驗(yàn)等。
　　通過(guò)O抗原和H抗原的玻片凝集法，395株菌共鑒定出8個(gè)血清群和41個(gè)血清型，62株沙門氏菌無(wú)法判定血清

4、群。 B群(n=205，44.86％)和C1群(n=141，30.85％)是優(yōu)勢(shì)血清群;Typhimurium12.47％(n=57)和Ⅲb4.81％(n=22)為優(yōu)勢(shì)血清型。雞源沙門氏菌中優(yōu)勢(shì)血清型為Typhimurium(n=20，4.38％)和Enteritidis(n=9，1.97％);豬源沙門氏菌中優(yōu)勢(shì)血清型為Ⅲb(n=22，4.81％)和Typhimurium(n=11，2.41％);奶牛源沙門氏菌中優(yōu)勢(shì)血清型為Typhim

5、urium(n=26，5.69％)和Agona(n=12，2.63％)。
　　用瓊脂稀釋法檢測(cè)了沙門氏菌對(duì)24種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示，188株菌(41.14％)對(duì)測(cè)試的抗生素全部敏感;220株菌(48.14％)在MIC表型上至少對(duì)一種抗生素耐藥;所有試驗(yàn)菌株對(duì)亞胺培南的敏感性表現(xiàn)出敏感或中介。萘啶酸、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素和四環(huán)素的耐藥性最高，分別為39.17％、39.61％、28.22％和27.58％。試驗(yàn)菌株對(duì)所有獸醫(yī)專用抗

6、生素均表現(xiàn)出耐藥性:恩諾沙星(24.51％);氟苯尼考(20.13％);頭孢噻呋(7.44％);頭孢喹肟(5.25％);對(duì)人畜共用抗生素也表現(xiàn)出耐藥性:環(huán)丙沙星(24.07％);慶大霉素(19.69％);頭孢曲松(6.34％);阿莫西林/克拉維酸(4.38％)。阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，其耐藥率為16.19％。在獸醫(yī)臨床上使用不多的抗生素也表現(xiàn)出了耐藥性，如多粘菌素B和磷霉素，耐藥率分別為18.82％和12.04％。在測(cè)試的24種抗

7、生素中，雞源和豬源沙門氏菌對(duì)23種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，耐藥率范圍分別為1.90％～49.52％和0.40％～48.18％;而奶牛源沙門氏菌僅對(duì)12種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，耐藥率范圍為0.95％～10.48％。159株(34.72％)沙門氏菌表現(xiàn)為耐3類以上抗生素多重耐藥菌，包括70株來(lái)自不同省份和不同健康動(dòng)物源的分離菌和89株來(lái)自華中農(nóng)業(yè)獸醫(yī)院患病豬源。
　　用MIC檢測(cè)和驗(yàn)證超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的結(jié)果表明有25株(5.

8、47％，n=457)沙門氏菌為產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌，3株來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院的豬源沙門氏菌為疑似產(chǎn)ESBLs的菌株。25株產(chǎn)ESBLs的沙門氏菌的來(lái)源于湖北的健康雞源沙門氏菌（2株）、河南的健康雞源沙門氏菌（15株）和華中農(nóng)業(yè)獸醫(yī)院的患病豬源沙門氏菌（8株）。
　　在沙門氏菌敏感菌株(n=188)中有80株菌株鑒定出了17個(gè)血清型，Typhimurium(n=28)是優(yōu)勢(shì)血清型。在多重耐藥的沙門氏菌菌株中鑒定出26個(gè)具體的血清型，

9、Enteritidis(n=10)和Ⅲb(n=10)為優(yōu)勢(shì)血清型，區(qū)別在于Enteritidis主要來(lái)自雞源，而Ⅲb主要來(lái)自患病豬源。在所有的血清型中，萘啶酸的耐藥性為100％。在多重耐藥沙門氏菌中，不同血清型菌株的耐藥表型略有差異。血清型為Enteritidis的10株菌株的耐藥表型是萘啶酸-復(fù)方新諾明-喹乙醇-乙酰甲喹;而血清型為Ⅲb的10株菌株的耐藥表型是氨芐西林-阿莫西林-萘啶酸-復(fù)方新諾明。
　　用PCR的方法對(duì)187株

10、在MIC表型中耐2類（含2類）不同抗生素的沙門氏菌檢測(cè)了140個(gè)耐藥基因。結(jié)果表明有58個(gè)(41.43％)耐藥基因經(jīng)檢測(cè)為陰性，82個(gè)(58.57％)耐藥基因經(jīng)檢測(cè)為陽(yáng)性。陽(yáng)性率在90％以上的耐藥基因有27個(gè)，分別為:2murA(n=173,92.51％),ISVsa3(n=177,94.65％),aadA2(n=179,95.72％), aadA1(n=180，96.26％)，merR和tolC均為181株(96.79％)， parE

11、和class1均為182株(97.33％)，emrB和mdlB均為184株(98.40％)，qacE△1(n=185，98.93％)，gyrA、gyrB、acrA和mdfA均為186株(99.47％)。以下的耐藥基因陽(yáng)性率為100％: parC、tetB、ompC、ompF、ramA、acrB、acrE、acrF、emrA、ydhE、mdtB和mdtC。
　　不同動(dòng)物來(lái)源的沙門氏菌在耐藥基因的分布上不僅有相同點(diǎn)，也存在差異。相同點(diǎn)

12、是81個(gè)陽(yáng)性耐藥基因中的63個(gè)陽(yáng)性耐藥基因在雞源、豬源和奶牛源沙門氏菌中均能檢測(cè)到，如ESBLs類、外排泵類和整合子類等。不同點(diǎn)則體現(xiàn)在:(1) ereB僅存在于奶牛源菌;marR、mcp/Tn1721、rmtB僅存在于雞源菌;dfrIa、DHA、tetC、Tn1、Tn2、Tn4、merA、rmtA僅存在于豬源菌;(2) dfrVI、CMY-2、tnp/Tn10、tnpR/Tn1721、ermB和fosA3存在于雞源菌和豬源菌。

13、　　140株不同來(lái)源的沙門氏菌為產(chǎn)ESBLs和AmpC菌株。92株菌含單個(gè)亞型耐藥基因:OXA-1(n=59),TEM-1(n=23),DHA(n=5),CTX-M-3(n=4),CMY-2(n=1)。雞源和奶牛源沙門氏菌攜帶了TEM-1、CTX-M-3和OXA-1;豬源沙門氏菌攜帶了TEM-1、CMY-2、DHA和OXA-1。河南省和湖南省分離的不同動(dòng)物源沙門氏菌均不含CMY-2、DHA;湖北省分離的沙門氏菌中不含DHA;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

14、獸醫(yī)院沙門氏菌不含CTX-M-3。43株沙門氏菌同時(shí)攜帶了兩種不同的耐藥基因亞型，以7種不同的組合方式呈現(xiàn)，分別是TME-1+CMY-2、TEM-1+DAH、TME-1+OXA-1、CTX-M-3+ DHA、CTX-M-3+OXA-1、OXA-1+CMY-2和OXA-1+DHA，而且這種耐藥基因組合的方式只存在與雞源和豬源沙門氏菌中。其余5株沙門氏菌表現(xiàn)出三種不同耐藥基因亞型同時(shí)存在的組合方式:TEM-1+OXA-1+CMY-2僅存在于

15、雞源沙門氏菌;TEM-1+OXA-1+DHA和CTX-M-3+OXA-1+DHA都只存在于豬源沙門氏菌中。
　　產(chǎn)ESBLs和AmpC的140株菌株中，共有有23種明確血清型。Ⅲb(group C1)、Enteritidis，Typhimurium為優(yōu)勢(shì)血清型。140株菌均為至少耐2類（含耐2類）不同抗生素的多重耐藥菌，以8重耐藥菌、11重耐藥菌和10重耐藥菌最多，分別為24株、23株和20株。在81個(gè)陽(yáng)性耐藥基因中，這140株菌

16、含有除ereB，ESBLs和AmpC之外的75個(gè)耐藥基因(92.59％，75/81)。攜帶aac(6')-Ib-cr的有81.43％株(114/140)，攜帶oqxA、oqxB分別為44.29％(62/140)、42.14％(59/140)，同時(shí)攜帶這三種基因的有41.43(58/140)。攜帶class1和class1-int-vair的分別為97.86％(137/140)，9.29％(13/140)。同時(shí)攜帶這五種耐藥基因(aac(

17、6')-Ib-cr+oqxA+oqxB+ class1+class1-int-vair)的有7.86％(11/140)。攜帶轉(zhuǎn)座子和插入元件的范圍是0.71％～95.00％。
　　187株沙門氏菌用PCR方法檢測(cè)了26個(gè)毒力因子，結(jié)果表明:陽(yáng)性毒力因子有23個(gè)(88.46％，23/26);僅有g(shù)ipA、flgK和siiD為陰性。在陽(yáng)性毒力因子中，stn、hilA、prgH、sopB、bcfC、fimA、rpoS的陽(yáng)性率為100％;

18、其余陽(yáng)性毒力因子的陽(yáng)性率在11.76％～99.47％。與T3SS-1、T3SS-2有關(guān)的avrA、ssaQ的陽(yáng)性率分別為70.59％、83.42％。
　　經(jīng)MLST分析，沙門氏菌共有5種STs，ST1(36.90％)、ST6(28.88％)和ST4(13.90％)為優(yōu)勢(shì)的ST型。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院患病豬源菌株中ST6(n=51)和ST1(n=39)為優(yōu)勢(shì)型;其他三省不同健康動(dòng)物來(lái)源菌株中ST1(n=30)和ST4(n=23)為優(yōu)勢(shì)

19、型。雞源菌株中優(yōu)勢(shì)型為ST4(n=20)和ST1(n=12);豬源菌株中優(yōu)勢(shì)型為ST1(n=13);奶牛源菌株中優(yōu)勢(shì)型為ST1(n=5)。產(chǎn)ESBLs和AmpC的沙門氏菌中ST1(n=55，39.29％)為優(yōu)勢(shì)型。
　　將187株沙門氏菌的血清型和MLST進(jìn)行分析，結(jié)果表明共有66株菌(35.29％，66/187)同時(shí)擁有確定的血清型和ST。在B群中有21株菌，表現(xiàn)為10種不同的血清型，和3種STs(ST1、ST6和ST57)，其

20、中ST1(n=18)最多，涵蓋了全部的血清型。在C1群中有25株菌，表現(xiàn)為9種不同的血清型和2種STs(ST1和ST6); ST1(n=8)涵蓋了5種血清型， ST6(n=20)涵蓋了7種血清型。全部9株D1群菌僅為ST4，但同時(shí)表現(xiàn)出不同的血清型(Enteritidis和Ⅱ);3株為E1群的三個(gè)血清型菌株均為ST65;8株為E4群有4個(gè)血清型和3種STs(ST1、ST4和ST65)。
　　3.華中地區(qū)畜禽金黃色葡萄球菌耐藥和毒力

21、的流行性及分子特征研究
　　從2185份采集的健康動(dòng)物樣品中共分離到85株金黃色葡萄球菌，分離率為3.89％(85/2185);其中雞源菌、豬源菌和奶牛源菌的分離率依次為3.11％(26/837)、3.44％(32/930)和6.46％(27/418)。24株(28.24％，24/85)金黃色葡萄球菌分離菌株為凝固酶陰性，其中雞源菌株最多(54.17％，13/24)。用PCR的方法鑒定了金黃色葡萄球菌的血清型，56株菌(65.88

22、％，56/85)為cap5型，15株菌(17.65％，15/85)為cap8型，其余14株菌(16.47％，14/85)為非cap5和非cap8。cap5為優(yōu)勢(shì)血清型。
　　用瓊脂稀釋法檢測(cè)了金黃色葡萄球菌對(duì)30種抗生素的敏感性，結(jié)果表明85株分離菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、阿莫西林/克拉維酸、頭孢喹肟、亞胺培南、阿米卡星均為敏感菌株;對(duì)下列藥物的MIC表型變現(xiàn)為耐藥率超過(guò)50％:青霉素(67.06％)、氨芐西林(64.71％)、阿莫西林(9

23、4.12％)、四環(huán)素(60.00％)、萘啶酸(97.65％)、復(fù)方新諾明(77.65％)、林可霉素(61.18％)、紅霉素(94.12％)、阿奇霉素(94.12％)和喹乙醇(96.47％)。所有金黃色葡萄球菌分離菌株表現(xiàn)出至少耐2類不同的抗生素。多重耐藥菌中以耐8類不同抗生素的菌株數(shù)量最多(n=30)，其次是耐9類不同抗生素(n=19)和耐5類不同抗生素(n=18)。24株凝固酶陰性金黃色葡萄球菌均為多重耐藥菌。12.5％(3/24)的

24、菌株為4重耐藥菌;33.33％(8/24)的菌株為5重耐藥菌;6重耐藥菌和7重耐藥菌均只有4.17％(1/24);45.83％(11/24)的菌株為8重耐藥菌。
　　金黃色葡萄球菌檢測(cè)的95個(gè)耐藥基因中，陽(yáng)性基因有55個(gè)(57.89％，55/95)，其余40個(gè)(42.11％，40/95)基因?yàn)殛幮?。?yáng)性耐藥基因中攜帶率為100％的有13個(gè)，分別為emB,emX,etK,InuA/A'，InuA,grlA,grlB,ant4'-Ia

25、,class1,norA,norB,norC，mepA;另有攜帶率≥90％的耐藥基因11個(gè)，分別為pbp4，ermB，ermC，ermT，tet38，gyrA，gyrB，cat:pc221，aphA3，dfrA(S1)，dfrG。這些耐藥基因主要的耐藥抗生素類別和耐藥機(jī)制表現(xiàn)為青霉素類，β-內(nèi)酰胺類，四環(huán)素類，林可酰胺類，氟喹諾酮類，氨基糖苷類，TMP，外排泵和整合子。
　　金黃色葡萄球菌檢測(cè)的66個(gè)毒力因子中，陽(yáng)性因子有45個(gè)(

26、68.18％，45/66)，其余21個(gè)(31.82％，21/66)因子為陰性。以下12個(gè)毒力因子在分離菌株中攜帶率為100％: hla，hlgv，hld; lukED; lbp; bbp; sak; efb，fnbA，clfA，clfB，ebp。與TSST-1(Toxic shock syndrome tosin)相關(guān)的毒力因子tst的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
　　經(jīng)過(guò)MLST分析，85株金黃色葡萄球菌分離菌共得到了6個(gè)STs:ST5(n

27、=30，35.29％), ST7(n=24,28.23％), ST9(n=16,18.82％), ST398(n=7,8.24％), ST464(n=1，1.18％)，ST2750(n=1，1.18％);其余6株菌(7.06％)沒(méi)有得到具體的ST型。ST5、ST7和ST9為優(yōu)勢(shì)型;僅ST5同時(shí)存在于三種不同動(dòng)物源的分離菌中。在凝固酶陰性金黃色葡萄球菌中，ST5(54.17％)和ST7(33.33％)是優(yōu)勢(shì)型。
　　4株菌攜帶了me

28、cA，成為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin，MRSA)，來(lái)源分別為河南省雞源1株（該菌株同時(shí)為凝固酶陰性菌株），湖北省豬源1株，湖南省豬源2株。3株MRSA為cap5，另1株MRSA對(duì)cap5和cap8均為陰性。2株MRSA為ST7，2株MRSA為ST9。它們均為多重耐藥菌:來(lái)自河南省雞源菌表現(xiàn)為八重耐藥菌;來(lái)自湖北省豬源菌為五重耐藥菌;來(lái)自湖南省豬源的2株菌均為九重耐藥菌。同時(shí)，這些MRSA攜帶了其他46個(gè)(83.64

29、％，46/55)陽(yáng)性耐藥基因。
　　將85株金黃色葡萄球菌的血清型，ST型和多重耐藥性進(jìn)行聯(lián)系，結(jié)果表明，血清型為cap5的菌株在5種不同的STs中均有分布，以ST5和ST9中的數(shù)量最多;血清型為cap8的菌株表現(xiàn)為3種不同的STs，以ST7中的數(shù)量最多。ST5型菌株主要表現(xiàn)為四重耐藥菌和五重耐藥菌;ST7型菌株主要表現(xiàn)為八重耐藥菌;ST9和ST398的菌株主要表現(xiàn)為九重耐藥菌。
　　4.華中地區(qū)畜禽空腸彎曲桿菌的流行性研究

30、
　　從2185份采集的健康動(dòng)物樣品中鑒定出18株空腸彎曲桿菌，分別來(lái)自雞源(n=6)和豬源(n=12)。用瓊脂稀釋法檢測(cè)了空腸彎曲桿菌對(duì)27種抗生素的敏感性，結(jié)果表明，對(duì)多西環(huán)素和四環(huán)素的耐藥率均為100％;對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素的耐藥率分別為66.67％和88.87％;對(duì)其他的抗生素也表現(xiàn)出了較高的耐藥性。
　　綜上所述，來(lái)自河南省、湖北省和湖南省養(yǎng)殖場(chǎng)（雞、豬和奶牛）健康動(dòng)物中均能分離到沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿