利用IMPACT-TWIN系統(tǒng)制備降鈣素和胰島素類似物的研究.pdf

1、生物活性肽是一類活性好、利用率較高的化合物。目前，已有多種生物活性多肽作為藥物用于臨床治療。本文研究了兩種活性肽的生物制備方法。論文包括兩個(gè)部分，第一部分是人源降鈣素類似物的生物制備。第二部分是重組B27賴氨酸去三肽胰島素前體(MIP，monomericB27Lysdestripeptideinsulinprecursor)融合蛋白包含體復(fù)性方法的研究。
　　在第一部分，實(shí)驗(yàn)制備了環(huán)狀和線性的人源降鈣素類似物。骨質(zhì)疏松現(xiàn)已成為世界

2、范圍的健康問(wèn)題，目前全球發(fā)病率已超過(guò)25％，躍居常見(jiàn)病、多發(fā)病的第7位。降鈣素是臨床應(yīng)用中治療骨質(zhì)疏松最有效的藥物之一。因?yàn)槿嗽唇碘}素來(lái)源有限，目前臨床常用的降鈣素為鮭魚(yú)降鈣素。但是鮭魚(yú)降鈣素存在一定的免疫源性，所以改進(jìn)人源降鈣素的制備方法是亟待解決的一個(gè)課題。降鈣素生理活性與其C末端酰胺化結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因此，通過(guò)基因工程方法制備人源降鈣素，必須進(jìn)行體外的C末端酰胺化，這導(dǎo)致制備過(guò)程復(fù)雜且成本較高。目前的研究表明對(duì)于末端酰胺化的活性肽可

3、以通過(guò)頭尾環(huán)化的方式得到與線性肽活性相近的環(huán)狀類似物，這不僅解決了線性肽C末端酰胺化的問(wèn)題，而且環(huán)肽具有更穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)和功能活性。本實(shí)驗(yàn)采用了大腸桿菌IMPACT-TWIN(InteinMediatedPurificationwithanAffinityChitin-bindingTag-TwoIntein)表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)不同的克隆方法可以獲得頭尾相連的環(huán)肽或線性肽。在制備過(guò)程中經(jīng)幾丁質(zhì)親和純化和內(nèi)含肽剪接即可獲得無(wú)冗余氨基酸殘

4、基的活性肽。整個(gè)制備過(guò)程具有步驟少、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。論文制備了兩種人源降鈣素類似物。其中，人源降鈣素類似物chCalcitonin(ΔAP)(cyclichumancalcitonin)為C末端缺失兩個(gè)氨基酸殘基的環(huán)狀人源降鈣素類似物。另一種人源降鈣素類似物hCalcitonin(humancalcitonin)為全長(zhǎng)線性的人源降鈣素類似物。采用IMPACT-TWIN表達(dá)系統(tǒng)獲得18.5mg/L環(huán)狀人源降鈣素chCalcitonin(ΔA

5、P)初純品，經(jīng)質(zhì)譜鑒定其分子量與理論值一致，表明這一生物制備方法是可行的。在人源降鈣素類似物hCalcitonin的研究中，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為16℃，16h，0.05mMIPTG。
　　在論文第二部分，主要探討重組B27賴氨酸去三肽胰島素前體MIP融合蛋白包含體的復(fù)性方法。速效胰島素是一類通過(guò)基因工程方式獲得，與餐后正常人體內(nèi)胰島素分泌代謝時(shí)相最為接近的胰島素類似物。B27賴氨酸去三肽

6、胰島素(B27K-DTrI)是由本實(shí)驗(yàn)室制備的一類速效胰島素類似物。其活性為野生型人胰島素的80％，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。在大腸桿菌中重組表達(dá)的B27賴氨酸去三肽胰島素前體(MIP)融合蛋白為包含體，需要經(jīng)過(guò)體外變復(fù)性后才能恢復(fù)其生物活性。因此，提高其復(fù)性率是獲得大量有活性的B27K-DTrI的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)比較了三種復(fù)性方法（透析法、稀釋法及凝膠過(guò)濾層析法）對(duì)MIP復(fù)性率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)性效果較好為43.6％。在此基礎(chǔ)上，對(duì)