不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞和BMP2在鼓室硬化發(fā)生機(jī)制中的作用研究.pdf

1、鼓室硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還存在爭(zhēng)論。雖然不同組織和器官硬化的病因、臨床表現(xiàn)和自然病程等方面有差別，但鼓室硬化與其他器官硬化在細(xì)胞水平和分子水平的纖維化形成過(guò)程是相似的。既往的研究已經(jīng)證明巨噬細(xì)胞是鼓室硬化的細(xì)胞基礎(chǔ)。然而，巨噬細(xì)胞參與鼓室硬化的分子機(jī)制及其信號(hào)通路尚不明料。骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein2，BMP2)是有效的骨生成誘導(dǎo)因子，參與鈣化、骨化過(guò)程；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxis

2、omeproliferators—activatedreceptorγ，PPARγ)通路參與器官纖維化、硬化的發(fā)生；以上兩者在巨噬細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)。本研究設(shè)計(jì)將巨噬細(xì)胞株Ana-1和小鼠中耳黏膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，體外模擬中耳炎癥條件，通過(guò)檢測(cè)中耳黏膜成纖維細(xì)胞的增殖、BMP2基因表達(dá)以及PPAR—γ途徑的調(diào)控影響，揭示不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞、BMP2以及PPAR—γ途徑在鼓室硬化中的作用，旨在探索鼓室硬化的發(fā)生機(jī)制，為鼓室硬化防治提供實(shí)驗(yàn)依

3、據(jù)和研究線索。 本研究分為三章。 第1章巨噬細(xì)胞和BMP2在鼓室硬化黏膜組織中的定位和表達(dá) 目的:檢測(cè)巨噬細(xì)胞、BMP2在鼓室硬化的中耳黏膜中的定位和表達(dá)，探討巨噬細(xì)胞、BMP2在鼓室硬化發(fā)生機(jī)制中的作用。方法:選取17例鼓室硬化的病例，以及17例年齡、性別、病程相匹配的單純慢性化膿性中耳炎病例，應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)病變黏膜的巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD68、以及BMP2蛋白在兩組標(biāo)本的定位和表達(dá)情況。結(jié)果:兩組中CD68

4、陽(yáng)染細(xì)胞均主要分布于黏膜下層中，黏膜層中僅有少量分布。兩組中，陽(yáng)性病例均為12例(12/17，70.59％)，兩組病例的CD68陽(yáng)染細(xì)胞數(shù)量無(wú)差別(P=0.79)，鼓室硬化組為6.94±6.08，慢性化膿性中耳炎組為7.59±7.84。兩組均有BMP2陽(yáng)染細(xì)胞表達(dá)，BMP2蛋白廣泛表達(dá)于中耳黏膜層、黏膜下層。兩組的BMP2陽(yáng)染細(xì)胞數(shù)及平均光密度值均有顯著差異(p＜0.05)。在鼓室硬化組中，鈣化斑周圍有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和大量BMP2陽(yáng)性著色

5、，鈣化斑周圍的部分細(xì)胞同時(shí)有CD68和BMP2陽(yáng)性著色。結(jié)論:巨噬細(xì)胞參與了鼓室硬化，可能通過(guò)分泌BMP2在鼓室硬化形成中起重要作用。 第2章不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞的BMP2基因和PPARγ基因表達(dá)及其相關(guān)性 目的:通過(guò)了解巨噬細(xì)胞在不同激活狀態(tài)下BMP2基因表達(dá)的變化以及與PPARγ基因表達(dá)的關(guān)系；并引入PPARγ配體羅格列酮，了解PPARγ活化與BMP2基因表達(dá)的關(guān)系；以探討不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞的功能。方法:體外培養(yǎng)小

6、鼠巨噬細(xì)胞株Ana-1；用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和地塞米松(Dexamethasone，DEX)分別激活巨噬細(xì)胞，得到經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞和選擇性激活巨噬細(xì)胞，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附劑檢測(cè)(enzyme—linkedimmunosorbnentassay，ELISA)法和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainr

7、eaction，F(xiàn)Q—RT—PCR法)檢測(cè)不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞的BMP2蛋白和基因表達(dá)，分析其相關(guān)性；再加入羅格列酮培養(yǎng)不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，運(yùn)用FQ—RT—PCR法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞的BMP2和PPAR—γ的基因表達(dá)。結(jié)果:不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞Ana-1的BMP2的蛋白表達(dá)與其基因表達(dá)呈正相關(guān)。選擇性激活組巨噬細(xì)胞的BMP2蛋白表達(dá)和基因表達(dá)最高(p＜0.05)，另兩組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。激活組巨噬細(xì)胞的PPAR—γ表達(dá)雖然

8、較高，但與未激活組比較無(wú)顯著差異(p＞0.05)。隨著羅格列酮濃度增加，三組巨噬細(xì)胞的PPARγ基因表達(dá)均增高，兩激活組于10umol/L達(dá)到高峰(p＜0.05)，且選擇性激活的巨噬細(xì)胞表達(dá)最高(p＜0.05)；三組巨噬細(xì)胞的BMP2基因表達(dá)均顯著降低(p＜0.05)。結(jié)論:選擇性激活的巨噬細(xì)胞分泌更多BMP2，后者可能在硬化斑形成中發(fā)揮主要作用，可以通過(guò)活化PPARγ通路來(lái)減弱巨噬細(xì)胞的BMP2表達(dá)。 第3章不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)

9、胞對(duì)小鼠中耳粘膜成纖維細(xì)胞增殖和分泌BMP2的影響 目的:通過(guò)小鼠中耳成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)中耳成纖維細(xì)胞的增殖情況與BMP2、PPARγ基因表達(dá)的關(guān)系，探討PPARγ通路在防治鼓室硬化的可行性。方法:在與不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的中耳成纖維細(xì)胞中加入PPARγ特異性配體羅格列酮，運(yùn)用FQ—RT—PCR法檢測(cè)各組的BMP2和PPAR—γ的基因表達(dá)。并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK—8試劑盒)檢測(cè)各種濃度羅格列酮影響下巨噬

10、細(xì)胞株Ana-1、小鼠中耳成纖維細(xì)胞的增殖情況以及與不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下中耳成纖維細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:中耳成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，尤其是與激活的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，中耳成纖維細(xì)胞的BMP2mRNA表達(dá)升高。在與激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，中耳成纖維細(xì)胞的BMP2mRNA表達(dá)和PPARγmRNA表達(dá)呈顯負(fù)相關(guān)(r=—0.507p=0.035)。隨著羅格列酮濃度增加，四組中耳成纖維細(xì)胞PPARγmRNA的表達(dá)均升高，10

11、umol/L為最有效濃度，經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組的PPARγmRNA表達(dá)始終最高；相反，四組中耳成纖維細(xì)胞BMP2mRNA的表達(dá)均降低，10umol/L為最有效濃度，選擇性激活巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組的BMP2mRNA表達(dá)始終最高。各種濃度羅格列酮對(duì)巨噬細(xì)胞株Ana-1、小鼠中耳成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)影響(p>0.05)，與不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的各組中耳成纖維細(xì)胞增殖無(wú)顯著差別(p>0.05)。結(jié)論:不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞會(huì)影響中耳成纖