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文檔簡介
1、2005年以來數(shù)個獨立的研究組報告了BCR/ABL陰性骨髓增殖性疾病(MPD)中存在JAK2基因突變,JAK2基因突變位于JAK2基因第1849位,原來的鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代(G→T),導(dǎo)致原位于617位的纈氨酸錯義編碼為苯丙氨酸(JAK2V617F)。國外報告JAK2V617F突變見于65%~90%的真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、23%~57%的特發(fā)性血小板增多癥(ET)和35%~57%特發(fā)性骨髓纖維化(IMF),是MPD發(fā)
2、生的重要分子機制。JAK2V617F突變引起人們廣泛關(guān)注而稱為“MPD的JAK2時代”。然而,JAK2V617F突變國內(nèi)報道較少,其作為臨床診斷依據(jù)的價值仍需大量的臨床資料驗證?JAK2V617F突變導(dǎo)致MPD的發(fā)病機制還不清楚?JAK2V617F突變相關(guān)的信號通路及其下游靶基因還有待進一步研究?在臨床上對110例惡性血液病患者檢測了JAK2V617F基因突變,并應(yīng)用細(xì)胞模型探索JAK2V617F突變相關(guān)的信號通路及其靶基因,為相關(guān)靶向
3、藥物的研發(fā)提供新的靶點和理論依據(jù),對闡明其作用的分子機制有重要意義。 目的: ①在臨床上探索JAK2V617F突變在BCR/ABL陰性MPD患者中的特異性、發(fā)生率及其臨床意義,并確立一種敏感特異、簡便快捷的實驗診斷體系; ②應(yīng)用細(xì)胞模型,研究JAK2V617F突變相關(guān)的信號通路; ③尋找JAK2V617F(JAK/STAT),信號通路調(diào)控的下游靶基因,探索與細(xì)胞增殖和凋亡異常的相關(guān)性,以期進一步闡明PV的
4、發(fā)病機制。 方法: ①臨床上對110惡性血液病患者和10例正常對照的外周血或骨髓粒細(xì)胞提取基因組DNA,采用等位基因特異性PCR(AS-PCR)、限制性內(nèi)切酶消化方法檢測JAK2V617F突變,并對BCR/ABL陰性MPD41例和正常對照2例進行基因測序鑒定; ②選擇人紅白血病細(xì)胞株HEL細(xì)胞為模型,用上述三種方法檢測和驗證HEL細(xì)胞模型中存在天然的JAK2V617F突變,并對HEL細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色和染
5、色體核型進行觀察; ③應(yīng)用Western blot方法研究HEL細(xì)胞中JAK2特異性抑制劑AG490干預(yù)對JAK2/STAT5信號通路中的JAK2、STAT5、磷酸化JAK2和磷酸化STAT5蛋白表達(dá)的影響; ④CellTiter-Glo 法和FITC-AnnexinV/PI雙染后的流式細(xì)胞技術(shù)分別用于檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況; ⑤應(yīng)用RT-PCR技術(shù)篩選JAK2/STAT5信號通路可能的下游靶基因(GATA1、G
6、ATA2、PTTG1、bcl-x)。Western blot技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)用于進一步檢測HEL細(xì)胞中AG490對PTTG1的蛋白表達(dá)水平的影響; ⑥雙熒光素酶報告基因技術(shù)用于檢測AG490對PTTG1啟動子的影響。 結(jié)果: ①AS-PCR和限制性內(nèi)切酶的方法檢測JAK2V617F陽性的結(jié)果為:PV11/12例(91.7%)、ET8/15例(53.3%)、IMF4/7例(57.1%)。高嗜酸粒細(xì)胞增多癥(HES
7、)7例、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)25例、急性白血病44例[包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)24例、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)18例、慢性粒細(xì)胞白血病急粒變1例、急性混合細(xì)胞白血病1例]均未檢測到JAK2V617F基因突變。將所有BCR/ABL陰性MPD患者41例、正常對照2例一并進行基因測序鑒定,結(jié)果顯示AS-PCR和限制性內(nèi)切酶的方法檢測JAK2V617F陽性的23例患者為JAK2V617F突變型,其他標(biāo)本為野生型; ②通過
8、AS-PCR、限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序,證實了HEL細(xì)胞中存在JAK2V617F突變,并且細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)觀察也提示該細(xì)胞株具有紅系細(xì)胞的形態(tài)特征; ③Western blot結(jié)果表明在總蛋白上樣量一致的情況下,隨著AG490作用時間(0小時、12小時、24小時、48小時、72小時)的延長,JAK2蛋白總量表達(dá)變化不大,但是磷酸化JAK2的表達(dá)逐漸下降,最大下降95.3%;同樣STAT5的總蛋白水平變化不大,磷酸化的ST
9、AT5表達(dá)水平明顯降低,最大下降72.4%。在K562細(xì)胞中,在100μM的AG490作用72小時后蛋白JAK2、磷酸化JAK2、STAT5、磷酸化STAT5的表達(dá)水平均沒有明顯變化; ④用50μM AG490干預(yù)后(0小時、24小時、48小時、72小時、96小時和120小時),HEL細(xì)胞增殖活力與對照組比較明顯降低; ⑤通過FITC-AnnexinV/PI雙染法和流式細(xì)胞技術(shù),發(fā)現(xiàn)AG490作用之后HEL細(xì)胞的凋亡率明
10、顯升高,并呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性; ⑥通過RT-PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)AG490干預(yù)HEL細(xì)胞后癌基因PTTG1和凋亡相關(guān)基因Bcl-X(主要為bcl-XL)mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào),并呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性;而轉(zhuǎn)錄因子GATA1和GATA2mRNA的表達(dá)水平無明顯變化; ⑦用100μMAG490(0小時、12小時、24小時、48小時、72小時)干預(yù)HEL細(xì)胞,Westernblot技術(shù)觀察到,隨著AG490作用
11、時間的延長,PTTG1的蛋白表達(dá)明顯下降;流式細(xì)胞技術(shù)檢測未加藥時PTTG1表達(dá)陽性率為55.9%,隨著AG490作用時間的延長,PTTG1陽性細(xì)胞的百分比下降,72小時后的細(xì)胞陽性率僅為9.0%; ⑧通過雙報告基因技術(shù),發(fā)現(xiàn)AG490作用之后,PTTG1的啟動子活性下降2.5倍。 結(jié)論: ①90%以上的PV、50%以上的ET和IMF可檢測到JAK2V617F基因突變;AS-PCR和限制性內(nèi)切酶分析是JAK2V6
12、17F基因突變敏感特異、簡便快捷的檢測方法;JAK2V617F可以作為MPD診斷的分子標(biāo)志,也可能是治療的新靶點; ②在HEL細(xì)胞中JAK2激酶特異性抑制劑AG490可以抑制突變的JAK2V617F激酶和JAK2V617F/STAT5信號通路,使HEL細(xì)胞增殖活力明顯降低和凋亡率明顯升高;而AG490導(dǎo)致Bcl-x(主要是Bcl-XL)基因的mRNA表達(dá)明顯降低,提示JAK2V617F可能通過上調(diào)Bcl-XL抑制細(xì)胞凋亡;
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