慢性骨髓增殖性腫瘤JAK2V617F基因突變的定性及定量研究.pdf

1、[背景與目的]： 近來研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)真性紅細(xì)胞增多癥(PV)和半數(shù)左右的原發(fā)性血小板增多癥(ET)及不明原因的骨髓纖維化(IMF)患者可存在JAK2V617F突變，上述分子事件不但對闡明慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)的發(fā)病機制有重要意義，而且對于其診斷、鑒別診斷具有指導(dǎo)意義。鑒于JAK2V617F的發(fā)現(xiàn)在CMPN研究中的里程碑意義及其在CMPN中的高表達(dá)率，2008年，WHO將JAK2V617F列入PV、ET及IMF的診斷標(biāo)

2、準(zhǔn)，并將JAK2V617F突變檢測作為PV診斷的起始性步驟。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，該突變存在純合和雜合兩種類型，且突變型與野生型JAK2基因的比例影響了CMPN的表型。本研究在先期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴大樣本量，動態(tài)觀察了JAK2V617F突變與CMPN患者的臨床特征及其并發(fā)癥間的相關(guān)性；鑒于目前國內(nèi)尚未見關(guān)于JAK2V617F突變分型及定量研究的文獻(xiàn)報道，我們通過建立可行可信的ARMS(Amplification-refractory mu

3、tation sequencing)-PCR檢測方法，對136例CMPN患者進(jìn)行了JAK2V617F突變分型，并聯(lián)合毛細(xì)管電泳定量分析了JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平與與部分臨床參數(shù)間的相關(guān)性，初步探討其臨床意義。 [方法]： 第一部分：通過建立等位基因特異性PCR方法，研究了412例CMPN患者的JAK2V617F突變發(fā)生情況。412例CMPN患者均為我院2005年8月至2008年12月門診及住院患者。按照2001年

4、世界衛(wèi)生組織(WHO)分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，PV114例，ET229例，IMF24例，慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病(CEL)1例，慢性中性粒細(xì)胞白血病(CNL)2例，不能分類的骨髓增殖性疾病(MPD-U)42例。正常對照為20名健康志愿者。主要研究方法為：(1)采集患者骨髓或外周血2ml，F(xiàn)icoll-paque分離單個核細(xì)胞，運用基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA的抽提；(2)采用等位基因特異性PCR技術(shù)(AS-PCR)擴增JAK2基因，擴增產(chǎn)物進(jìn)行

5、瓊脂糖凝膠電泳，篩選出突變陽性患者PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序證實。 第二部分：通過建立JAK2V617F基因突變分型及相對定量檢測方法，研究136例CMPN患者的JAKV617F突變發(fā)生情況，初步探討其臨床意義。136例患者均為2003年8月至2008年6月我院就診患者，按照2001年WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，PV38例，ET94例，IMF4例，正常對照為20名健康志愿者。主要研究方法為：(1)采集患者外周血10ml，F(xiàn)icoll-paque

6、分離中性粒細(xì)胞細(xì)胞，Trizol一步法抽提總RNA，應(yīng)用鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補cDNA；(2)建立ARMS-PCR檢測技術(shù)，并通過該方法擴增JAK2基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因突變分型，篩選出突變陽性患者PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序證實；(3)通過毛細(xì)管電泳檢測患者JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平，定量分析JAK2V617F突變與部分臨床參數(shù)間的相關(guān)性。 [結(jié)果]： 1.412例CMPN患者中JAK2V617F

7、陽性277例，該突變在PV、ET、IMF及MPD-U中的的發(fā)生率分別為95.6％、55.9％、66.7％和52.4％，2例CNL患者均檢測到JAK2V617F，1例CEL患者未檢出JAK2V617F。20例正常對照無一例JAK2V617F陽性。 2.經(jīng)過1-22個月的動態(tài)隨訪發(fā)現(xiàn)，18例JAK2V617F陽性的MPD-U患者有7例進(jìn)展為典型PV，4例進(jìn)展為典型ET，1例為CNL，其余6例仍不能分類；17例JAK2V617F陰性患

8、者中2例進(jìn)展為典型ET，其余仍不能分類；比較JAK2V617F陰性及陽性患者進(jìn)展結(jié)果，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 3.通過ARMS-PCR法檢測136例CMPN患者外周血，共檢出JAK2V617F陽性96例，該突變在PV、ET及IMF中的發(fā)生率分別為97.4％、59.6％和75％；其中純合突變在PV、ET及IMF中的發(fā)生率分別為47.3％、18.1％和25％；純合突變在PV中的發(fā)生率高于ET(P＜0.05)；純合突變

9、者其JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平為(89.5±6.0)％，高于雜合突變患者的(56.9±6.4)％(P＜0.05)；雜合型PV患者JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平為(64.0±6.7)％，高于雜合型ET患者的(53.5±6.2)％(P＜0.05)。 4.JAK2V617F突變高表達(dá)組(轉(zhuǎn)錄本水平70％～100％)的平均年齡為(61.4±14.7)歲，高于低表達(dá)組的(53.4±12.4)歲，且兩者均較JAK2V617F陰性組的

10、平均年齡(41.6±15.8)歲為高(P<0.05)；年齡>60歲者其JAK2V617F突變轉(zhuǎn)錄本水平為(82.6±9.4)％，高于年齡<60歲者的(60.0±6.7)％(P<0.05)；JAK2V617F突變高表達(dá)組外周白細(xì)胞計數(shù)為(23.59±10.3)×109/L，高于低表達(dá)組的(13.36±7.9)×109/L，且二者均較陰性組的(9.42±4,5)×109/L為高(P<0.05)。 [結(jié)論]： 1.中國PV、E

11、T、IMF患者中JAK2V617F突變發(fā)生率較高，檢測MPD-U患者中JAK2V617F的發(fā)生情況對疾病發(fā)展有提示作用。 2.ARMS-PCR方法檢測JAK2V617F基因突變及突變類型方法簡便、結(jié)果可靠，聯(lián)合毛細(xì)管電泳，可用于微小殘留病監(jiān)測。 3.JAK2V617F純合突變在PV中的發(fā)生率高于ET，JAK2V617F純合突變的轉(zhuǎn)錄本水平高于雜合突變，發(fā)生JAK2V617F雜合型突變的PV患者的轉(zhuǎn)錄本水平高于雜合型ET。