JAK2V617F突變在骨髓增殖性腫瘤和急性髓性白血病(M2)中的實驗和臨床研究.pdf

1、[背景與目的] 近年來慢性骨髓增殖性腫瘤(MPN)發(fā)病機制的研究取得了重要進展，2005年幾個研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)，MPN患者造血細胞信號傳導分子JAK2基因第1849位鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取替，導致JAK2激酶617位纈氨酸(V)錯義編碼為苯丙氨酸(JAK2V617F)，使JAK2分子得到持續(xù)活化，此改變可能與MPN的發(fā)病有密切的關聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)真性紅細胞增多癥(PV)患者和半數(shù)左右原發(fā)性血小板增多癥(ET)患

2、者及原發(fā)性骨髓纖維化(MF)患者中能檢測到此突變，而在骨髓增生異常綜合癥、急性白血病患者中偶爾也能檢測到此突變。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)此突變有兩種類型——純合型突變和雜合型突變，并發(fā)現(xiàn)突變型JAK2V617F與野生型JAK2基因的比例決定MPN的表型。因此，對JAK2V617F突變的研究有利于MPN的診斷，判定疾病的預后和未來靶向治療靶點的選擇，成為MPN研究的熱點。近年國內對JAK2V617F突變的研究主要集中于臨床檢測，未能做到對此突

3、變的進一步基因分型和相對定量研究，針對此我們研究了中國人MPN患者和急性白血病M2型患者中JAK2V617F突變的發(fā)病率、基因分型、相對定量情況和臨床資料間的關系，總結如下。 [方法] 第一部分第一章選取2005年8月～2008年10月該院門診就診MPN患者，按照2001年WHO分類診斷標準選擇患者，采集患者外周血5ml，F(xiàn)icoll-paque分離單個核細胞，運用基因組DNA抽提試劑盒進行DNA的抽提，采用等位基因特異

4、性PCR技術(AS-PCR)擴增JAK2基因，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選出突變陽性患者PCR產物進行測序證實，收集患者的臨床資料、染色體結果及隨訪結果。 第一部分第二章選取2006年1月到2008年6月間到該院就診的急性白血病M2型患者及部分我所凍存標本作為研究對象，按照《血液學診斷及療效標準》選擇患者，收集患者的臨床資料，采集患者的外周血，運用AS-PCR(同第一部分第一章)擴增JAK2基因，并結合臨床資料進行研究。

5、 第二部分和第三部分選取2006年1月到2008年6月間到該院就診的MPN患者及部分該所凍存標本作為研究對象，按照2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)慢性骨髓增殖性疾病診斷標準選擇患者，采集患者外周血10ml，F(xiàn)icoll-paque分離單個核細胞，Trizol一步法抽提總RNA，應用鼠源逆轉錄酶將RNA逆轉錄為互補cDNA，采用ARMS-PCR技術擴增JAK2基因，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行基因分型，篩選出突變陽性患者PCR產物進行

6、測序證實，并經毛細管電泳進行JAK2V617F突變轉錄本水平的相對定量分析，染色體檢查按照常規(guī)R顯帶技術進行，同時分析檢測結果與臨床間的關系。 [結果] 1.運用AS-PCR方法檢測了412例MPN患者，根據(jù)檢測結果結合臨床資料顯示：共發(fā)現(xiàn)277例患者JAK2V617F突變陽性，JAK2V617F突變在原發(fā)性血小板增多癥(ET)、特發(fā)性骨髓纖維化(IMF)及不能分類的骨髓增殖性疾病(MPD-U)中發(fā)生率分別為55.9％、

7、66.7％和52.4％，差異無統(tǒng)計學意義，但均較真性紅細胞增多癥(PV)中JAK2V617F發(fā)生率(95.6％)為低；JAK2突變型患者的平均年齡高于野生型患者；JAK2V617F陽性組的白細胞水平及血紅蛋白水平均較JAK2V617F陰性組為高；JAK2V617陽性組中血管事件發(fā)生率高于陰性組；具有JAK2V617F陽性的MPD-U患者較陰性MPD-U患者更易進展為典型MPN；301例進行過染色體檢查的患者中，18例存在核型異常，未發(fā)現(xiàn)

8、核型異常與JAK2V617F突變之間存在相關性。 2.運用AS-PCR方法檢測了80例AML-M2患者，根據(jù)檢測結果結合臨床資料顯示：80例AML-M2患者中共發(fā)現(xiàn)JAK2V617F陽性7例，6例為初診患者，1例為復發(fā)患者，總陽性率8.8％；7例JAK2V617F陽性AML-M2患者形態(tài)學上血象、骨髓象呈現(xiàn)出白血病改變特征，并無骨髓增殖性疾病(MPD)癥象，免疫分型顯示為髓系表達；本院治療5例JAK2V617F陽性AML-M2患

9、者，4例經2療程誘導治療達完全緩解(CR)，1例未緩解(NR)；5例JAK2V617F陽性AML-M2患者，除1例失訪外，其余4例總生存期(0S)中位值為18.5個月。 3.運用ARMS-PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測123例MPN患者，結果顯示： JAK2V617F陽性90例，其中35例真性紅細胞增多癥(PV)患者中JAK2V617F陽性35例，陽性率100％(35/35)，85例原發(fā)性血小板增多癥(ET)患者中JAK2V617F陽

10、性53例，陽性率62.4％(53/85)，低于PV患者，差別有顯著性；3例慢性骨髓纖維化(IMF)患者中JAK2V617F陽性2例，陽性率66.7％(2/3)。90例JAK2V617F突變患者中共檢出純合突變35例，其中PV患者17例(17/35)占48.6％，ET患者17例(17/85)占20％，低于PV患者，差別有顯著性，IMF患者1例；90例毛細管電泳定量分析顯示，35例純合型突變患者JAK2V617F突變轉錄本水平為(89.5±

11、6.5)％，55例雜合型突變患者JAK2V617F突變轉錄本水平為(57.9±6.7)％，較純合型突變患者為低，差別有顯著性；雜合型PV患者JAK2V617F突變轉錄本水平為(63.7±6.3)％，高于雜和型ET患者的(54.4±6.1)％，差別有顯著性。93例患者進行了染色體檢查，6例有核型異常，但未發(fā)現(xiàn)特異性染色體改變。 4.運用ARMS-PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測了131例MPN患者，根據(jù)檢測結果結合臨床資料顯示：純合型JA

12、K2V617F突變ET患者和雜合型JAK2V617F突變ET患者其發(fā)病年齡均較野生型患者為高；MPN患者中年齡與JAK2V617F突變的發(fā)生間存在相關性，≥60歲患者JAK2V617F突變轉錄本水平高于<60歲患者；JAK2V617F突變陽性MPN患者(PV和ET)白細胞和血紅蛋白水平均高于陰性患者，ET患者中純合型突變者白細胞水平高于雜合型突變者；JAK2V617F突變在PV中的發(fā)生率和JAK2V617F純合型突變在PV中的發(fā)生率均較

13、JAK2V617F突變在ET中的發(fā)生率和JAK2V617F純合型突變在ET中的發(fā)生率為高；JAK2V617F轉錄本水平均值在PV、ET和IMF患者中無差別。 5.運用ARMS-PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測了105例MPN患者，根據(jù)檢測結果結合臨床資料顯示：有血栓PV、ET患者年齡、WBC數(shù)高于無血栓患者，WBC≥15×109/LET患者血栓發(fā)生率高于WBC<15×109/L患者，JAK2V617F陽性患者血栓發(fā)生率高于陰性患者，有血

14、栓事件者JAK2V617F轉錄本水平高于無血栓事件者，JAK2V617F陽性患者血栓事件風險度高于JAK2V617F陰性患者，突變轉錄本水平在(60-100)％組患者血栓事件風險度高于JAK2V617F陰性組患者。 [結論] 1.JAK2V617F突變與MPN患者年齡、外周血細胞計數(shù)及血管事件之間存在關聯(lián)性，JAK2V617F的檢測對判定MPN-U患者疾病轉歸有提示作用。 2.作為AML發(fā)病機制中的I類改變JAK

15、2V617F突變可能并非是AML發(fā)病的初始事件，而是其發(fā)病的額外事件，初診AML患者出現(xiàn)此改變也并非意味著疾病預后較差。 3.ARMS-PCR可作為JAK2V617突變分型較準確的檢測方法，結合毛細管電泳可用于此突變的相對定量分析。 4.ARMS-PCR結合毛細管電泳定性和定量分析JAK2V617F突變可用于MPN的診斷、預后判定和微小殘留病的檢測。 5.高齡、白細胞計數(shù)增高，JAK2V617F突變及高轉錄本水平