當歸多糖在體外抑制HCMV感染所致巨核系細胞凋亡中的應(yīng)用探討.pdf

1、近年來隨著免疫低下人群的增多，HCMV感染及其引發(fā)的嚴重疾病受到重視，其中對造血系統(tǒng)分化和增殖的抑制又是其中的熱點，本課題組自1997年以來已完成了HCMV對粒一巨噬系祖細胞(CFU-GM)、紅系祖細胞(CFU-E)、多向造血祖細胞(CFU-Mix)、巨核系祖細胞(CFU-MK)及前髓系細胞影響的研究，證實了HCMV體外感染對它們均有抑制，并呈濃度依賴性，同時也證實了HCMV體外感染CHRF細胞、HL-60細胞可加重其凋亡，且呈劑量依賴

2、性。隨著研究的不斷深入，相應(yīng)地干預(yù)細胞凋亡的手段可望成為治療此類凋亡相關(guān)性疾病的新策略，目前已有大量的臨床實踐表明，單獨用中藥或中西結(jié)合治療此類疾病療效確切。本試驗就是在此基礎(chǔ)上，用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)測試手段，從細胞學(xué)角度探討當歸多糖在體外治療HCMV感染致人巨核系細胞凋亡中的作用，以便為臨床用藥治療HCMV感染引起的血小板減少性疾病提供理論指導(dǎo)和依據(jù)，也為開發(fā)中藥，發(fā)揚祖國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)提供新的思路。 材料和方法： 1．材料

3、 HCMV AD169株由中國武漢病毒研究所提供，效價為10<'-5>TCID<,50>/ml。病毒原液分裝凍存管，-80℃低溫冰箱儲存。CHRF-288-11細胞株、當歸多糖(APS)由香港中文大學(xué)兒科系實驗室提供。 2．方法 CHRF-288-11細胞株用含10﹪FBS、100單位/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5﹪CO2條件下培養(yǎng)，每周換液2次，傳代1次。取對數(shù)增殖期

4、細胞做實驗。 HCMV原液直接感染A組CHRF細胞株，使其終濃度為10<'-2>原液，于病毒感染后第3天加入不同濃度的當歸多糖(APS)，根據(jù)加入HCMV及APS濃度的不同，實驗分為五組，并設(shè)對照組。 A1大劑量APS組(CMV+LAPS) APS終濃度為200 μ g/ml． A2中劑量APS組(CMV+MAPS) APS終濃度為100 μ g/ml． A3小劑量APS組(CMv+SAPS) APS終濃

5、度為50 μ g/ml． A4對照組未加入APSB 空白組未加入HCMV 未加入APS然后于不同時間收集各組細胞，分別進行凋亡檢測。 (1)PCR擴增在病毒感染A組后第3天收集各組細胞，抽提DNA，做PCR擴增檢測HCMV IEA，電泳后觀察是否有特異性陽性條帶，以鑒定HCMV是否直接感染CHRF細胞株。并分別向各組加入不同濃度當歸多糖。 (2)Hoechst染色對不同時間的各組細胞進行染色，即刻在熒光顯微鏡下觀

6、察細胞形態(tài)。細胞內(nèi)核DNA出現(xiàn)不同程度固縮、碎裂的細胞即為凋亡細胞。 (3)MTT法收集不同時間的各組細胞，加入MTT顯色后，在酶標儀檢測光密度值，計算細胞存活率。 (4)DNA ladder收集不同時間的各組細胞，常規(guī)抽提DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有特征性凋亡梯形條帶。 (5)AImexin V/PI雙染流式細胞儀分析收集不同時間的各組細胞，每組至少10<'6>個細胞，PBS清洗、離心，加入Anne

7、xin V/FITC和碘化丙錠溶液，混勻后避光染色；同時以不加Amlexin V/FITC及PI的為對照，用400目絲網(wǎng)過濾后，即刻用流式細胞儀分析檢測凋亡細胞。 結(jié)果： 1．PCR擴增后，在2﹪的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下可見HCMV IEA特異性擴增條帶。 2．在HCMV感染CHRF細胞后第3、5、7天，通過Hoechst染色在各組可觀察到不同程度的凋亡細胞，而在其對照組凋亡細胞則相對較多。 3．在A

8、組中，于HCMV感染的第3天加入APS后，對不同時間的細胞進行MTT法檢測，記錄細胞存活率(﹪)。第5天，CMV+LAPS組86.46±5.11， CMV+MAPS組76.57 ±5.78，CMV+SAPS組66.17±4.24，對照組55.94±5.05，空白組117.50±4.31；第7天，CMV+LAPS組76.66±3.13，CMV+MAPS組65.57±7.22，CMV+SAPS組54.48 ±4.27，對照組43.40±6.

9、94，空白組131.83±7.22。結(jié)果顯示在HCMV感染的A組細胞中，隨著加入當歸多糖劑量的增加，細胞存活率有上升的趨勢。 4．在病毒感染后第5天，收集各組細胞抽提DNA，經(jīng)電泳可見各組的特征性梯形條帶，在HCMV感染的A組中隨著加入當歸多糖劑量的減少，條帶逐漸清晰。 5．在A組中，于HCMV感染的第3天加入APS后，Annexin V/PI染色觀察凋亡細胞，記錄凋亡率(﹪)。第5天，CMV+LAPS組26.10±1.

10、99，CMV+MAPS組30.11±1.85， CMV+SAPS組34.79±1.79，對照組37.84±0.97，空白組10.34±0.84；第7天， CMV+LAPS組38.70±1.37，CMV+MAPS組43.22±1.51，CMV+SAPS組47.71±2.78，對照組52.20±3.38，空白組19.42±2.88。從結(jié)果可觀察到，在HCMV感染的A組中隨著加入當歸多糖劑量的減少，凋亡率呈上升趨勢。 結(jié)論：