當(dāng)歸多糖在體外抑制HCMV感染所致巨核系細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用探討.pdf

1、近年來(lái)隨著免疫低下人群的增多，HCMV感染及其引發(fā)的嚴(yán)重疾病受到重視，其中對(duì)造血系統(tǒng)分化和增殖的抑制又是其中的熱點(diǎn)，本課題組自1997年以來(lái)已完成了HCMV對(duì)粒一巨噬系祖細(xì)胞(CFU-GM)、紅系祖細(xì)胞(CFU-E)、多向造血祖細(xì)胞(CFU-Mix)、巨核系祖細(xì)胞(CFU-MK)及前髓系細(xì)胞影響的研究，證實(shí)了HCMV體外感染對(duì)它們均有抑制，并呈濃度依賴性，同時(shí)也證實(shí)了HCMV體外感染CHRF細(xì)胞、HL-60細(xì)胞可加重其凋亡，且呈劑量依賴

2、性。隨著研究的不斷深入，相應(yīng)地干預(yù)細(xì)胞凋亡的手段可望成為治療此類(lèi)凋亡相關(guān)性疾病的新策略，目前已有大量的臨床實(shí)踐表明，單獨(dú)用中藥或中西結(jié)合治療此類(lèi)疾病療效確切。本試驗(yàn)就是在此基礎(chǔ)上，用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)測(cè)試手段，從細(xì)胞學(xué)角度探討當(dāng)歸多糖在體外治療HCMV感染致人巨核系細(xì)胞凋亡中的作用，以便為臨床用藥治療HCMV感染引起的血小板減少性疾病提供理論指導(dǎo)和依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)中藥，發(fā)揚(yáng)祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)提供新的思路。 材料和方法： 1．材料

3、 HCMV AD169株由中國(guó)武漢病毒研究所提供，效價(jià)為10<'-5>TCID<,50>/ml。病毒原液分裝凍存管，-80℃低溫冰箱儲(chǔ)存。CHRF-288-11細(xì)胞株、當(dāng)歸多糖(APS)由香港中文大學(xué)兒科系實(shí)驗(yàn)室提供。 2．方法 CHRF-288-11細(xì)胞株用含10﹪FBS、100單位/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5﹪CO2條件下培養(yǎng)，每周換液2次，傳代1次。取對(duì)數(shù)增殖期

4、細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。 HCMV原液直接感染A組CHRF細(xì)胞株，使其終濃度為10<'-2>原液，于病毒感染后第3天加入不同濃度的當(dāng)歸多糖(APS)，根據(jù)加入HCMV及APS濃度的不同，實(shí)驗(yàn)分為五組，并設(shè)對(duì)照組。 A1大劑量APS組(CMV+LAPS) APS終濃度為200 μ g/ml． A2中劑量APS組(CMV+MAPS) APS終濃度為100 μ g/ml． A3小劑量APS組(CMv+SAPS) APS終濃

5、度為50 μ g/ml． A4對(duì)照組未加入APSB 空白組未加入HCMV 未加入APS然后于不同時(shí)間收集各組細(xì)胞，分別進(jìn)行凋亡檢測(cè)。 (1)PCR擴(kuò)增在病毒感染A組后第3天收集各組細(xì)胞，抽提DNA，做PCR擴(kuò)增檢測(cè)HCMV IEA，電泳后觀察是否有特異性陽(yáng)性條帶，以鑒定HCMV是否直接感染CHRF細(xì)胞株。并分別向各組加入不同濃度當(dāng)歸多糖。 (2)Hoechst染色對(duì)不同時(shí)間的各組細(xì)胞進(jìn)行染色，即刻在熒光顯微鏡下觀

6、察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞內(nèi)核DNA出現(xiàn)不同程度固縮、碎裂的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。 (3)MTT法收集不同時(shí)間的各組細(xì)胞，加入MTT顯色后，在酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。 (4)DNA ladder收集不同時(shí)間的各組細(xì)胞，常規(guī)抽提DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有特征性凋亡梯形條帶。 (5)AImexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀分析收集不同時(shí)間的各組細(xì)胞，每組至少10<'6>個(gè)細(xì)胞，PBS清洗、離心，加入Anne

7、xin V/FITC和碘化丙錠溶液，混勻后避光染色；同時(shí)以不加Amlexin V/FITC及PI的為對(duì)照，用400目絲網(wǎng)過(guò)濾后，即刻用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)凋亡細(xì)胞。 結(jié)果： 1．PCR擴(kuò)增后，在2﹪的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下可見(jiàn)HCMV IEA特異性擴(kuò)增條帶。 2．在HCMV感染CHRF細(xì)胞后第3、5、7天，通過(guò)Hoechst染色在各組可觀察到不同程度的凋亡細(xì)胞，而在其對(duì)照組凋亡細(xì)胞則相對(duì)較多。 3．在A

8、組中，于HCMV感染的第3天加入APS后，對(duì)不同時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測(cè)，記錄細(xì)胞存活率(﹪)。第5天，CMV+LAPS組86.46±5.11， CMV+MAPS組76.57 ±5.78，CMV+SAPS組66.17±4.24，對(duì)照組55.94±5.05，空白組117.50±4.31；第7天，CMV+LAPS組76.66±3.13，CMV+MAPS組65.57±7.22，CMV+SAPS組54.48 ±4.27，對(duì)照組43.40±6.

9、94，空白組131.83±7.22。結(jié)果顯示在HCMV感染的A組細(xì)胞中，隨著加入當(dāng)歸多糖劑量的增加，細(xì)胞存活率有上升的趨勢(shì)。 4．在病毒感染后第5天，收集各組細(xì)胞抽提DNA，經(jīng)電泳可見(jiàn)各組的特征性梯形條帶，在HCMV感染的A組中隨著加入當(dāng)歸多糖劑量的減少，條帶逐漸清晰。 5．在A組中，于HCMV感染的第3天加入APS后，Annexin V/PI染色觀察凋亡細(xì)胞，記錄凋亡率(﹪)。第5天，CMV+LAPS組26.10±1.

10、99，CMV+MAPS組30.11±1.85， CMV+SAPS組34.79±1.79，對(duì)照組37.84±0.97，空白組10.34±0.84；第7天， CMV+LAPS組38.70±1.37，CMV+MAPS組43.22±1.51，CMV+SAPS組47.71±2.78，對(duì)照組52.20±3.38，空白組19.42±2.88。從結(jié)果可觀察到，在HCMV感染的A組中隨著加入當(dāng)歸多糖劑量的減少，凋亡率呈上升趨勢(shì)。 結(jié)論：