廣西豬PRV分子病原學(xué)調(diào)查及快速鑒別野毒感染雙功能性分子的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一種高度接觸性傳染病，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前雖然已經(jīng)建立了區(qū)分疫苗免疫和野毒PR感染的PCR和ELISA方法，但是這些方法均需要特殊的儀器和有工作經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行操作，不適合基層生產(chǎn)單位使用，因此迫切需要一種簡便、快速的鑒別診斷方法。 基于國內(nèi)廣泛應(yīng)用gE基因缺失苗進(jìn)行免疫的現(xiàn)狀，利用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的原理，

2、將一種抗人紅細(xì)胞非凝集型單抗的單鏈抗體基因(2E8)與PRV-gE抗原表位基因融合，構(gòu)建一種用于快速鑒別PRV野毒株感染的重組雙功能分子，建立一種利用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)進(jìn)行PR野毒感染的鑒別診斷方法。若該診斷方法研制成功，將對該病的快速診斷具有重要的作用。 為了獲得雙功能性分子中PRV gE抗原肽，并摸清當(dāng)前廣西PRV的流行病學(xué)情況和遺傳變化規(guī)律，對來源于廣西13個(gè)地(市)122個(gè)不同規(guī)模豬場163份病料進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果檢測出P

3、RV陽性6份，陽性率3.7％；gE-ELISA血清學(xué)檢測玉林、南寧、桂林、貴港等8個(gè)規(guī)模豬場的61份血清，其中7份呈陽性，陽性率11．5％。對6株P(guān)RVgE胞外基因進(jìn)行序列測定，并同國內(nèi)外PRV代表株及廣西地方株相應(yīng)基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示6株毒株同國內(nèi)毒株MinA株、GXB株、GXW株、Ea株、SH株、LA：株核苷酸同源性在97.8～99.0％之間，氨基酸同源性為96.5～99.0％，與國外毒株Rice株核苷酸和氨基酸同源性最低，分

4、別為96．4～97.0％，93．6～95.2％。研究表明，廣西PRV同國內(nèi)毒株親緣關(guān)系密切，變異情況不大；調(diào)查顯示PR的檢出率并不高，說明我區(qū)PR的防控工作已初見成效，但調(diào)查表明一些規(guī)模豬場仍存在PRV隱性感染的情況，這提醒我們PRV防控工作仍不能放松。 將篩查出的6份PRV陽性樣品進(jìn)行病毒的分離工作，目前僅分離出一株P(guān)RV病毒。該病毒接種家兔后引起典型的奇癢、神經(jīng)癥狀，接種PK-15細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，病毒效價(jià)(TCID5

5、0)為10-7.22/0.1ml，PCR擴(kuò)增出與目的片段大小相符的帶，與國內(nèi)外不同PRV毒株進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)該毒株與其它5株廣西毒株及國內(nèi)MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.4％～99.8％之間，氨基酸同源性在97.8％～99.4％之間，與國外毒株Rice株相比，核苷酸和氨基酸的同源性均較低，分別為97.0％和95.2％，結(jié)果證實(shí)該分離毒為偽狂犬病病毒，命名為GXBB-1株。將該病毒株gE胞外基因

6、作為構(gòu)建雙功能分子的抗原肽部分進(jìn)行試驗(yàn)。 用oligo軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建2E8-gE融合基因的引物，將抗人紅細(xì)胞H抗原的單鏈抗體基因2E8同GXBB PRV gE胞外基因，利用SOE PCR方法拼接起來，并回收片段，同PMDl8-T simple vector連接，經(jīng)PCR、測序鑒定成功實(shí)現(xiàn)了兩段基因的連接，且讀碼框正確。將重組質(zhì)粒PMD-2E8-gE進(jìn)行雙酶切(BamHI和EcoRI)，回收2E8-gE片段，并與同樣雙酶切的表達(dá)載體