蛋白質(zhì)組學(xué)分析重組腺病毒介導(dǎo)hSSTR2基因轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響及Lv-VIM-shRNA的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：蛋白質(zhì)組學(xué)分析腺病毒介導(dǎo)hSSTR2基因轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響
　　 目的：探討Hsstr2基因轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1蛋白表達(dá)的影響；尋找新的胰腺癌敏感治療靶點(diǎn)。
　　 方法：利用腺病毒載體Ad.CMV.Egfp.Hsstr2.將Hsstr2全長(zhǎng)Cdna導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞Panc-1，用RT-PCR及Western Blot分別檢測(cè)Hsstr2在Mrna水平及蛋白水平

2、上的表達(dá)。采用熒光差異蛋白組學(xué)（2D-DIGE）技術(shù)分離并篩選轉(zhuǎn)染Hsstr2的實(shí)驗(yàn)組、空載體對(duì)照組以及空白組胰腺癌細(xì)胞之間差異表達(dá)蛋白；用反射式基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI—TOF/TOF)技術(shù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行鑒定。采用Western Blot驗(yàn)證波形蛋白、PKM2、SEPT11的差異表達(dá)；采用免疫組化檢測(cè)上述三種蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：Hsstr2成功的轉(zhuǎn)染了胰腺癌細(xì)胞，建立了Hsstr2

3、陰性和陽(yáng)性表達(dá)胰腺癌細(xì)胞Panc-1熒光差異蛋白表達(dá)圖譜。經(jīng)DeCyder v6.5軟件分析，共得到21個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；選擇1.3倍以上的差異點(diǎn)18個(gè)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到13個(gè)蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)染Hsstr2的胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)蛋白為GMP合酶、磷酸化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白、谷氨酸脫氫酶、Septin-11、波形蛋白、異檸檬酸脫氫酶α亞基、線粒體內(nèi)膜易位酶；高表達(dá)蛋白為真核延長(zhǎng)因子1α1、丙酮酸激酶異構(gòu)體M2型、烯酰-CoA水合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因

4、子1-β、Mitofilin、HSP105。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)篩選的差異蛋白功能涉及到糖、脂肪以及核酸代謝,細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。對(duì)這些蛋白質(zhì)功能的進(jìn)一步驗(yàn)證，將有助于解析缺失Hsstr2基因表達(dá)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，從而為尋找新的胰腺癌敏感治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分：Lv-VIM-shRNA的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建人VIM基因RNA干擾(RNAi)慢病毒表達(dá)載體,并評(píng)價(jià)其在胰

5、腺癌細(xì)胞中的干擾效果。
　　 方法：利用在線軟件設(shè)計(jì)3條人VIM基因shRNA序列，并選用一條文獻(xiàn)報(bào)道序列，合成、退火形成雙鏈寡核酸后克隆到Pgcl-GFP/U6 載體的黏性末端，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR篩選陽(yáng)性克隆、測(cè)序鑒定。實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot用于在轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)質(zhì)粒Pegfp-N1-Hvim的293T細(xì)胞中篩選有效的Pgcl-GFP/U6-shRNA,將其和pHelper1.0、pHe

6、lper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并測(cè)定病毒滴度。Real-time PCR和Western Blot在胰腺癌細(xì)胞Panc-1中驗(yàn)證慢病毒(Lv-VIM-shRNA)干擾Vim Mrna和波形蛋白表達(dá)效果。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶VIM基因干擾序列的慢病毒表達(dá)載體，病毒滴度為2×109TU/ml。在胰腺癌細(xì)胞Panc-1中驗(yàn)證其干擾VIM基因效果，Vim Mrna和Vimentin表達(dá)明顯下調(diào)。