膽色素紅色熒光蛋白的分子定向進(jìn)化.pdf

1、線性四吡咯色素在藻膽蛋白、光敏色素等色素蛋白中起著吸收光能的作用，并以此調(diào)節(jié)光合作用和光形態(tài)發(fā)生。膽綠素(Biliverdin，BV)是血紅素代謝過程的中間產(chǎn)物，是由血紅素氧化酶1(heme oxygenase1，HO1)催化血紅素降解形成的線性四吡咯色素。一些能結(jié)合BV的色素蛋白，其吸收光譜和發(fā)射光譜大多靠近或位于光譜的紅光區(qū)。在生物組織成像領(lǐng)域，紅光具有穿透能力強(qiáng)、不易激發(fā)生物分子產(chǎn)生本底熒光等特點(diǎn)而使紅色熒光蛋白在熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)

2、域具有重要應(yīng)用前景。
　　 本課題首先克隆構(gòu)建了HO1和CpeS：HO1兩種蛋白并在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白能結(jié)合BV而發(fā)出622 nm的紅色弱熒光。根據(jù)這一特性，以HO1和CpeS：HO1蛋白作為親本型分別進(jìn)行定向進(jìn)化以提高熒光探針的亮度。
　　 首先以重組質(zhì)粒pET-30a(+)-cpeS：ho1為模板，通過易錯(cuò)PCR構(gòu)建突變體文庫，經(jīng)過初篩和復(fù)篩對(duì)文庫進(jìn)行篩選，得到一個(gè)有益突變體并命名為Mu-130，誘導(dǎo)表

3、達(dá)后細(xì)胞顏色深綠，經(jīng)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)突變體有兩個(gè)堿基的突變：T388A、T813C，其中T388A導(dǎo)致氨基酸序列第130位酪氨酸突變成了天冬酰胺Y130N，而T813C堿基突變?yōu)橥x突變。突變體和野生型蛋白表達(dá)純化后，進(jìn)行了一系列光譜學(xué)參數(shù)的測(cè)定。野生型熒光量子產(chǎn)率為0.015，摩爾消光系數(shù)為3938 M-1 cm-1，而突變體Mu-130熒光量子產(chǎn)率為0.008，摩爾消光系數(shù)為9895 M-1 cm-1。突變體和野生型相比熒光量子產(chǎn)率略有

4、下降，由0.015降為0.008，然而摩爾消光系數(shù)提高了2.51倍，由于摩爾消光系數(shù)的大幅度提高從而使突變體呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色。
　　 本課題還直接對(duì)HO1蛋白進(jìn)行了隨機(jī)突變，經(jīng)過初篩和復(fù)篩后，得到一個(gè)突變體，其在氨基酸序列第20位發(fā)生了A20V突變。野生型熒光量子產(chǎn)率為0.065，摩爾消光系數(shù)為4506 M-1 cm-1，而突變體Mu-130熒光量子產(chǎn)率為0.0734，摩爾消光系數(shù)為4088 M-1 cm-1。因此突變體熒光量子