生物可降解siRNA-PLGA-CSO共軛物膠束對(duì)SKOV3細(xì)胞STAT3基因沉默作用的研究.pdf

1、目的：利用siRNA干擾技術(shù)來(lái)抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）的表達(dá)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行STAT3 siRNA基因敲除效率的評(píng)估。然而，siRNA給藥系統(tǒng)仍然存在著許多不足，如轉(zhuǎn)染效率低、易被核酸酶降解等問(wèn)題。所以，設(shè)計(jì)高效、穩(wěn)定、安全的靶向SKOV3細(xì)胞中STAT3基因的siRNA載藥系統(tǒng)對(duì)增強(qiáng)抗卵巢癌作用具有非常重要的意義。本文制備了基于二硫鍵的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束，并對(duì)其制劑學(xué)特征

2、，在核酸酶中的穩(wěn)定性，細(xì)胞攝取效率，STAT3基因沉默效率，細(xì)胞增殖和凋亡等方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為構(gòu)建安全有效的抗腫瘤siRNA納米載體系統(tǒng)提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。
　　方法：首先，本文在調(diào)研了大量相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，采用NHS/DCC和PDPH通過(guò)兩步法合成并表征了siRNA-PLGA共軛物，在水性環(huán)境中自組裝形成siRNA-PLGA共軛物膠束，并與CSO按不同N/P比孵育后制備得到siRNA-PLGA/CSO膠束。其次，采用芘熒光探針

3、法測(cè)定siRNA-PLGA共軛物膠束的CMC值；利用動(dòng)態(tài)激光散射儀（DLS）測(cè)定siRNA-PLGA/CSO聚合物膠束的粒徑、粒徑分布和Zeta電位；透射電鏡（TEM）觀察膠束的形態(tài)，并用瓊脂糖凝膠電泳分析膠束在核酸酶存在條件下的穩(wěn)定性。最后，通過(guò)流式細(xì)胞儀考察了SKOV3對(duì)siRNA-PLGA/CSO膠束的攝取率，利用熒光定量PCR和Western Blot評(píng)價(jià)了膠束對(duì)STAT3基因的沉默效率，并采用CCK-8和細(xì)胞凋亡試劑盒測(cè)定了膠

4、束對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡兩方面的影響。
　　結(jié)果：核磁共振圖譜確證了 PLGA-PDPH的成功合成，其嫁接率為（94.26±2.11）％，siRNA-PLGA的接枝率為（87.41±2.87）%，其CMC值約為3mg/L。siRNA-PLGA膠束的粒徑為（204.97±9.72）nm，Zeta電位為（-43.48±1.33） mV，重現(xiàn)性良好。不同N/P比的siRNA-PLGA/CSO膠束的粒徑在150~190 nm之間，Ze

5、ta電位隨著N/P比的增加而上升，當(dāng)N/P比為80時(shí)，電位為（39.42±1.58）mV。透射電鏡觀察得到的siRNA-PLGA和siRNA-PLGA/CSO膠束均為近圓形。流式細(xì)胞儀測(cè)得siRNA-PLGA/CSO膠束的細(xì)胞攝取率隨N/P比的增加而增加，N/P比為80的 siRNA-PLGA/CSO膠束的細(xì)胞攝取率為（91.92±6.16）%，與lipofectamin2000組無(wú)顯著性差異。熒光定量PCR結(jié)果證明siRNA-PLGA

6、/CSO膠束（N/P=80）對(duì)STAT3 mRNA表達(dá)具有明顯的抑制作用，其2-ΔΔCt值為0.22±0.14，顯著低于對(duì)照組0.87±0.13。Western Blot結(jié)果表明，N/P比為80的siRNA-PLGA/CSO膠束組使得 STAT3蛋白的表達(dá)量明顯降低，蛋白表達(dá)為（33.32±8.99）%，顯著低于對(duì)照組（90.33±12.87）%。CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果證明，陰性siRNA-PLGA膠束作為siRNA的運(yùn)送載體，本身并

7、無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，但是STAT3 siRNA-PLGA/CSO膠束對(duì)細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，當(dāng)N/P=80，72h后，細(xì)胞存活率僅為（45.62±8.65）%，明顯低于對(duì)照組（93.54±6.37）%。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，siRNA-PLGA/CSO膠束組對(duì)細(xì)胞的凋亡具有明顯促進(jìn)作用，其細(xì)胞凋亡率為（18.64±3.37）%，明顯高于對(duì)照組（9.30±0.95）%。
　　結(jié)論：本研究制備的siRNA-PLGA/C