體細胞及腫瘤細胞重編程的研究和CRISPr-Cas9技術(shù)在急性早幼粒性白血病中應用研究.pdf

1、第一部分、體細胞及腫瘤細胞重編程的研究
　　研究背景和目的:血液系統(tǒng)惡性疾病的治療是世界性難題，化療或放療等手段雖能殺傷腫瘤細胞，但白血病干細胞往往逃逸或耐受其作用，重新增殖、分化致疾病復發(fā)。Lapidot等[1]1994年首次報道了血液惡性疾病中癌癥干細胞(Cancerstem cells，CSCs)的存在，但迄今為止分選及鑒定CSCs的方法與指標卻無統(tǒng)一標準，也無癌癥干細胞體外建系的報道。2006年Yamanaka等[2]成功

2、自體細胞獲得誘導性多潛能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)，是干細胞領域的突破性進展，開啟通過特定的手段將各種類型細胞重編程的新時代，包括惡性腫瘤細胞。使得體外建立惡性腫瘤疾病模型、研究其發(fā)病機制及藥物篩選等構(gòu)想有了實現(xiàn)的可能。本實驗嘗試對急性早幼粒細胞白血病細胞系NB4進行重編程獲得誘導性多潛能腫瘤細胞，同時在此過程中學習掌握重編程技術(shù)，為研究白血病腫瘤干細胞提供模型，進一步研究其發(fā)病機

3、制及藥物作用，為有效治療白血病奠定基礎。
　　材料和方法:1）用有效的轉(zhuǎn)染試劑將pMXs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Plat-E細胞，包被成攜帶有不同鼠源cDNA（Oct4、Sox2、 Klf4、c-Myc及Zscan4）的逆轉(zhuǎn)錄病毒，收集病毒檢測病毒滴度及感染效率，再感染OG2-MEF細胞。感染后熒光顯微鏡檢測GFP評估感染效率。將感染細胞與iMEF細胞共培養(yǎng)，熒光觀察GFP陽性克隆出現(xiàn)情況，挑出狀態(tài)好的克隆建立小鼠誘導性多潛能干細胞(mouse

4、 iPS cells，miPSCs)系。鑒定建系的miPSCs:①熒光觀察GFP陽性克隆形態(tài);②堿性磷酸酶(AP)染色;③核型分析;④畸胎瘤形成;⑤免疫熒光(IF):⑥r(nóng)t-PCR。2)將pMXs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細胞，包被成攜帶有不同人源cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，同上收集病毒，感染人前皮細胞(human foreskin cell，HFS)，流式檢測GFP表達評估效率，重鋪感染后細胞與HFF-feeder共培養(yǎng)直到出現(xiàn)克隆，挑克隆建系并同

5、上鑒定。3）培養(yǎng)NB4細胞，同2）中收集病毒原液過濾后懸浮感染NB4細胞，每24小時一次，共三次。最后一次感染后用流式細胞術(shù)評估效率。感染細胞與HFF-feeder共培養(yǎng)，觀察細胞生長狀態(tài)，對重編程程度鑒定。
　　結(jié)果:1）OG2-MEF細胞被攜帶鼠源Yamanaka因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)及Zscan4的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，轉(zhuǎn)變成形態(tài)小鼠胚胎干細胞(mouseembryonic stem cells，mES

6、Cs)類似的細胞:呈克隆樣生長，細胞間排列緊密，核質(zhì)比高。對miPSCs進行多能性鑒定:①克隆呈GFP陽性，形態(tài)類似mESCs;②AP染色陽性。③核型分析:miPS細胞染色體數(shù)目正常，為40條。④畸胎瘤實驗:向裸鼠皮下注射miPS細胞，6-8周形成畸胎瘤，制成石蠟切片經(jīng)HE染色后可見腺體、肌肉、神經(jīng)組織等內(nèi)、中、外胚層的組織。⑤免疫熒光示Nanog及Oct4陽性表達與mES一致。⑥r(nóng)t-PCR示miPS細胞與mES均內(nèi)源性表達Nanog

7、，Oct4及Sox2等基因，而MEF細胞中無相應表達。2）用攜帶人源Yamanaka因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HFS細胞并培養(yǎng)，出現(xiàn)形態(tài)與人胚胎干細胞相似的細胞:呈克隆性生長，細胞排列緊密，界限不清，核質(zhì)比高，與飼養(yǎng)層細胞分界清楚。對hiPSCs進行干性鑒定:①AP染色陽性;②核型分析:對hiPSCs進行核型分析，大多細胞染色體數(shù)目正常，為46條。③畸胎瘤實驗:向NOD/SCID小鼠皮下注射hiPS

8、細胞，8周后形成畸胎瘤，制成石蠟切片經(jīng)HE染色后可見腺體、肌肉、上皮組織等內(nèi)、中、外胚層的組織。④rt-PCR示hiPS細胞與H19均內(nèi)源性表達Nanog，Oct4及Sox2等基因，而HFS細胞中無相應表達。3）收集轉(zhuǎn)染后36h的人源逆轉(zhuǎn)錄病毒原液三輪重復感染方法感染NB4細胞;流式檢測GFP表達，估計病毒感染NB4細胞的效率約50％。感染后NB4細胞與HFF-feeder共培養(yǎng)，細胞出現(xiàn)成簇貼壁，未形成與hES細胞類似的形態(tài)。對成簇貼

9、壁生長的NB4細胞進行AP染色輕度淡然，rt-PCR檢測Nanog基因表達水平介于hES與NB4細胞之間。
　　結(jié)論:1）利用攜帶Yamanaka因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒，能將OG2-MEF細胞誘導性成多潛能干細胞，經(jīng)形態(tài)、AP染色、內(nèi)源干性基因表達、畸胎瘤形成、核型分析及免疫熒光等證實具有mES細胞相似的生物學特性。2）用人源Yamanaka因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HFS細胞，得到人誘導性多潛能干細胞(hiPSCs)，經(jīng)形態(tài)、AP染色、內(nèi)源

10、干性基因，核型分析及畸胎瘤形成等證實hiPS細胞具有hES類似特征。3）病毒原液三次重復感染NB4細胞，效率約50％，與HFF-feeder共培養(yǎng)后依據(jù)細胞形態(tài)、AP染色及基因表達鑒定，NB4細胞實現(xiàn)部分重編程。
　　第二部分、CRISPR-Cas9技術(shù)在急性早幼粒性白血病中應用研究
　　研究背景與目的:血液系統(tǒng)惡性或遺傳性疾病大多與基因改變有關系，通過對造血干細胞突變基因的修復可能是治愈白血病關鍵?？茖W家目前已報道應用同源

11、重組、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)與類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等技術(shù)在體外動物模型或細胞中通過基因修復來治療血液系統(tǒng)遺傳性疾病，但是尚未有在獲得性突變所致惡性血液病中應用的報道。2013年研究者報道一種全新的人工核酸內(nèi)切酶CRISPR/Cas9，是一成簇的、規(guī)律間隔的、短回文、重復序列

12、(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISP)與CRISPR-associated(Cas)9核酸內(nèi)切酶組成，具有高效的基因組編輯功能，已被應用于多種生物，包括人、小鼠、大鼠、斑馬魚等的基因編輯，本實驗目的是探索通過CRISPR/Cas9技術(shù)靶向干擾PML基因的序列，影響PML-RARα融合基因形成，打破其阻滯急性早有粒細胞的分化來達到治療疾病的目的。

13、r>　　材料和方法:1）構(gòu)建PX330-mcherry-PML質(zhì)粒:根據(jù)NCBI設計PML相關的Oligo，退火后形成短的雙鏈DNA，用T4連接酶將之與BbsI酶切后的PX330-mcherry載體連接。2）將構(gòu)建好的質(zhì)粒用Lipo2000轉(zhuǎn)染到293T細胞中，流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)ACS))評估轉(zhuǎn)染效率并分選陽性細胞培養(yǎng)，提取293T細胞基因組測序評價所構(gòu)質(zhì)粒的效果。3）將驗證后的質(zhì)粒用核電轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染到NB4細胞

14、中，而后根據(jù)RFP熒光進行FACS分選陽性細胞培養(yǎng)，2-4天提取DNA測序檢測效果，應用瑞氏吉姆薩染色細胞圖片觀察細胞分化形態(tài)。
　　結(jié)果:1）成功構(gòu)建PX330-mcherry-PML1、3、5、6四個質(zhì)粒，進行大量抽提備用。2）轉(zhuǎn)染293T細胞FACS后抽提基因組DNA測序提示PML-1、3、5能成功干擾PML基因序列。3）電轉(zhuǎn)NB4細胞的效率為30％左右，F(xiàn)ACS后培養(yǎng)2-4天，細胞死亡較多，提取基因組DNA測序，未測出信號