中國(guó)人原發(fā)性膽汁性肝硬化相關(guān)基因多態(tài)性研究.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化，是由免疫紊亂介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性非化膿性膽管炎性疾病，可引發(fā)肝內(nèi)中小膽管的損傷和肝內(nèi)膽汁淤積，病理表現(xiàn)為膽管破壞、門脈區(qū)炎癥及肝實(shí)質(zhì)碎屑狀壞死，最終可進(jìn)展為肝硬化。近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的加重、生活方式的日益西化，以及醫(yī)生對(duì)該病認(rèn)知程度的提高，PBC在中國(guó)的檢出率逐年升高。目前認(rèn)為，PBC是在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下，經(jīng)由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的一種自身免疫性疾病。許多報(bào)道顯示，PBC發(fā)病具有明顯的家族聚集現(xiàn)

2、象;雙胞胎發(fā)病率顯著增高; PBC一級(jí)親屬發(fā)病率比正常人發(fā)病率高100倍。這些都提示，遺傳因素在PBC的發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用。國(guó)外對(duì)PBC的基因易感位點(diǎn)進(jìn)行了大量的研究。通過(guò)文獻(xiàn)分析，高加索人和亞洲人的PBC相關(guān)SNP位點(diǎn)存在著明顯差異。這些基因的不用位點(diǎn)或不同位點(diǎn)的單倍型均不同程度的顯示與 PBC易感性有關(guān)。大量文獻(xiàn)顯示，東西方人群對(duì)比顯示不同種族或民族的基因多態(tài)性存在很大差異，提示歐美結(jié)果不能反映中國(guó)人的情況，又因?yàn)槟壳皣?guó)內(nèi)

3、這方面的研究較少，所以本研究通過(guò)研究候選基因多態(tài)性進(jìn)行中國(guó)人PBC相關(guān)基因易感多態(tài)性研究。
　　目的：
　　篩選中國(guó)人群中PBC基因易感位點(diǎn)，從影響人群膽汁分泌與排泄功能、小膽管損傷、免疫紊亂等方面，探討基因多態(tài)性對(duì)PBC遺傳易感性的影響。
　　方法：
　　通過(guò)大量文獻(xiàn)回顧查閱已經(jīng)報(bào)道的東西方人群中與自身免疫性疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)及基因，并根據(jù)當(dāng)前研究的與免疫性疾病相關(guān)SNPs，分析已發(fā)現(xiàn)的一些可能與PBC發(fā)病相

4、關(guān)SNPs位點(diǎn)，最終確定本課題將要篩選的基因。收集 PBC患者及對(duì)照全血，用SNP芯片檢測(cè)易感基因位點(diǎn)，通過(guò)質(zhì)譜分析得出基因分型結(jié)果并結(jié)合疾病相關(guān)臨床指標(biāo)等對(duì)其進(jìn)行多層統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　（1）根據(jù)目前已經(jīng)報(bào)道的與原發(fā)性膽汁性肝硬化以及與自身免疫性疾病和肝臟疾病相關(guān)的基因SNPs。針對(duì)參與免疫調(diào)節(jié)、膽汁排泄、膽管上皮損傷機(jī)制的19個(gè)基因中的49個(gè)SNPs設(shè)計(jì)引物并合成芯片。其中參與T細(xì)胞增殖、陽(yáng)性選擇的分子包括 P

5、TPN22、CTLT-4及HLA類分子。參與 Th1細(xì)胞分化的分子包括IL-12、IRF5、STAT4、IFN-γ及Tyk2等分子。參與膽汁合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及排泄的分子包括 MDR1、MDR3、BSEP、MRP2、CYP、AE2等。
　　（2）2004年7月到2011年8月共入組448例樣本：PBC患者（134例），對(duì)照（314例）。
　　（3）經(jīng)病例-對(duì)照分析基因型頻率分布，定位于BSEP基因的rs473351，兩組具有顯著性差

6、異（P=0.004）。定位于 STAT4基因的rs6748358，兩組具有顯著性差異（P=0.009）。定位于PTPN22基因的rs738409，兩組具有顯著性差異（P=0.020）。其余各點(diǎn)的基因型頻率分布均無(wú)顯著性差異。
　　（4）經(jīng)顯性模型、隱性模型以及共顯性遺傳模型分析，BSEP基因的位點(diǎn)rs473351與PBC的易感性有關(guān)，其突變堿基A（dominant model:OR,2.063；95％CI,1.254-3.393;

7、P=0.004）與PBC的易感性具高度相關(guān)性。位點(diǎn)rs2287618與PBC的易感性有關(guān)，其突變堿基A（dominant model, OR,0.617;95％CI，0.411-0.928; P=0.020）與PBC的易感性具高度相關(guān)性。STAT4 rs6748358與PBC的易感性有關(guān)，其突變堿基 A（dominant model, OR,1.567;95％CI，1.044-2.353;P=0.030）與PBC的易感性具高度相關(guān)性。<

8、br>　　（5）BSEP中rs473351與rs2287618具有高度連鎖性LD(D’>0.9)它們與定位在 BSEP的其他兩個(gè)位點(diǎn)不存在連鎖關(guān)系。多因子降解法分析顯示：基因 STAT4-PNPLA3位點(diǎn) rs738409、rs2235048、 rs2280714、 rs10181656次要位點(diǎn)組合的攜帶者，患病危險(xiǎn)率顯著高于其他人?；駼SEP-STAT4位點(diǎn)rs280519、rs473351、rs2280714、rs2461823、

9、rs10181656次要位點(diǎn)組合的攜帶者，患病危險(xiǎn)率顯著高于其他人。
　?。?）本研究納入臨床資料收集完整的PBC患者（96例），對(duì)BSEP基因多態(tài)性及臨床指標(biāo)（ALP、GGT、TBIL）相關(guān)性進(jìn)行 Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，攜帶rs2287618次要等位基因的個(gè)體與ALP值呈正相關(guān)（P<0.05）。同時(shí)，攜帶rs2287618次要等位基因的個(gè)體對(duì)UDCA的應(yīng)答水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）對(duì)PBC相關(guān)抗體

10、與BSEP基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，AMA陽(yáng)性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，二者具有顯著性差異。同時(shí)，Sp100抗體陽(yáng)性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而B(niǎo)PO、gp210等抗體陽(yáng)性率與攜帶此位點(diǎn)次要等位基因頻率比較，二者無(wú)顯著性差異。主要細(xì)胞因子，我們對(duì)21例PBC患者和21例對(duì)照進(jìn)行了Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析。IL-4、IL-10的表達(dá)水平在病例組和對(duì)照組具有顯著

11、差異（P值分別為0.04，0.033）；IL-2、IL-12、IL-17檢測(cè)結(jié)果顯示，PBC組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P值分別為0.24，0.12，0.07）。進(jìn)一步進(jìn)行 BSEP基因多態(tài)性與 IL-4、IL-10表達(dá)水平的邏輯回歸分析，結(jié)果沒(méi)有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　（1）從遺傳易感性角度篩選到了PBC相關(guān)SNPs：rs473351、rs2287618、rs6748358、rs738409等，首次發(fā)現(xiàn)基因 BSEP位點(diǎn)

12、rs473351，STAT4位點(diǎn)rs6748358，PTPN22位點(diǎn)rs738409的基因型分布在中國(guó)PBC患者中存在顯著性差異；等位基因同樣存在顯著性差異；說(shuō)明這些位點(diǎn)多態(tài)性可能與PBC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。
　　（2）首次對(duì)BSEP的基因多態(tài)性與PBC易感性關(guān)系的深入研究。遺傳模型證實(shí)突變BSEP可能是參與PBC發(fā)病的候選分子。模型分析顯示為BSEP基因位點(diǎn)rs473351、位點(diǎn)rs2287618，STAT4基因位點(diǎn)rs674835

13、8，攜帶A等位基因的人群患PBC的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。而rs473351的突變型致病性更強(qiáng)。由此可以看出，BSEP可能在PBC的發(fā)病過(guò)程中起著十分重要的作用。
　?。?）BSEP基因的rs473351、rs2287618存在緊密連鎖。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果顯示單倍體 AA（均為次要等位基因）顯著降低了PBC的發(fā)病率。相反,如果患者出現(xiàn) GG單倍型，則其發(fā)病率顯著增高。說(shuō)明其對(duì)PBC的發(fā)病可能起到了不可忽視的作用。進(jìn)行MDR分析后

14、，同時(shí)攜帶分別定位于BSEP、STAT4基因的次要等位基因位點(diǎn)組合的人群患PBC的概率顯著增高。同樣，攜帶STAT4、PNPLA3基因的次要等位基因位點(diǎn)組合的人群發(fā)生PBC的概率顯著高于其他人。這提示要對(duì)基因BSEP、STAT4以及其在免疫性疾病中的連鎖關(guān)系高度關(guān)注。
　　（4）ALP、GGT、TBIL是評(píng)估病情、判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。首次對(duì)BSEP基因多態(tài)性與 PBC相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行邏輯回歸分析，結(jié)果顯示 BSEP rs22876

15、18與ALP具有相關(guān)性，提示BSEP rs2287618可能是PBC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。一致率檢驗(yàn)顯示，判別UDCA應(yīng)答的兩種標(biāo)準(zhǔn)（Barcelona標(biāo)準(zhǔn)和PairsⅠ標(biāo)準(zhǔn)）具有良好的一致性。首次進(jìn)行BSEP基因多態(tài)性與UDCA應(yīng)答率（采用Barcelona標(biāo)準(zhǔn)）的邏輯回歸分析，攜帶rs2287618次要等位基因的個(gè)體對(duì)UDCA的應(yīng)答水平降低。這些都提示：BSEP rs2287618具有重要的研究意義。
　?。?）首次對(duì)BSEP基因多