巖藻糖化聚糖抗原在附睪中表達及與精子發(fā)育成熟相關(guān)性研究.pdf

1、在細胞膜表面存在大量糖綴合物，介導機體的生理及病理過程，如精卵識別、淋巴細胞歸巢、細菌與宿主細胞間黏附、炎癥反應(yīng)以及胚胎著床等。Lewis聚糖是巖藻糖化的乳糖系列聚糖，根據(jù)其糖鏈結(jié)構(gòu)不同分為Le<'X>、Le<'Y>、Le<'a>、Le<'b>、sLe<'X>等，而Le<'X>、Le<'Y>的差異只是末端巖藻糖Fucα1-2的有無。Lewis聚糖與個體發(fā)育、器官形成、造血細胞分化及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實驗室前期Lewis聚糖在雌性生

2、殖系統(tǒng)中的功能研究顯示：巖藻聚糖抗原Le<'Y>在著床期的子宮內(nèi)膜細胞和胚泡中持續(xù)高表達，在卵巢激素調(diào)節(jié)下作為信息分子參與母-胎識別、黏附和調(diào)控著床。催化Lewis聚糖合成的關(guān)鍵酶(巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶futs)在圍著床期子宮內(nèi)膜表達趨勢與Lewis聚糖蛋白表達一致，說明聚糖合成受其合成關(guān)鍵酶基因調(diào)控。 精子離開睪丸時雖然高度分化但并未完全成熟，其在通過附睪管運行過程中，與附睪管腔液的微環(huán)境相互作用，獲得前向運動能力和使卵子受精的潛能

3、。精子成熟過程主要在附睪完成，附睪頭部又是精子成熟主要發(fā)生區(qū)域。附睪上皮分泌的蛋白通過參與精子質(zhì)膜在頂體反應(yīng)、精卵識別和融合作用來調(diào)控精子的成熟和獲能。文獻報道人精漿中含有0.3-0.4mg/ml游離巖藻聚糖，并富含Le<'X>和Le<'Y>的抗原決定基和大量糖基轉(zhuǎn)移酶。本文采用c57鼠睪丸、附睪組織作為研究對象，利用Le<'X>和Le<'Y>兩種單克隆抗體，通過免疫組織化學、RT-PCR、Western-blot等技術(shù)，分析巖藻聚糖的

4、來源及定位，探討精漿中的巖藻聚糖與精子發(fā)育成熟的相關(guān)性，得到以下結(jié)果： (一)免疫組織化學檢測Le<'X>和Le<'Y>在小鼠睪丸、附睪不同區(qū)域(頭部、體部、尾部)的表達，結(jié)果顯示：在小鼠睪丸中沒有Le<'X>和Le<'Y>表達，而在附睪頭部及其腔內(nèi)所含的精子表面則強烈表達，在附睪體部、尾部表達減弱，具有高度區(qū)域特異性。RT-PCR結(jié)果顯示：Le<'X>合成的關(guān)鍵酶fut9在附睪頭部有強烈表達，體部及尾部表達減弱；Le<'Y>。

5、合成的關(guān)鍵酶futl、fut4加群表達從附睪頭部、體部和尾部呈逐漸降低趨勢，同一種基因表達具有顯著的區(qū)域特異性。鑒于巖藻糖化聚糖Le<'X>和Le<'Y>主要表達在附睪頭部，而附睪頭部又是精子成熟主要發(fā)生區(qū)域，提示Le<'X>及Le<'Y>在精子成熟過程具有重要作用。Western-blot結(jié)果顯示：Le<'X>分子量為30kDa～40kDa蛋白睪丸中強表達，附睪頭部、體部及尾部呈逐漸降低；而分子量為40kDa～60kDa蛋白附睪頭部、

6、體部及尾部呈逐漸升高；Le<'Y>睪丸、附睪不同區(qū)域均有表達，50kDa左右蛋白在附睪頭部、體部明顯表達，而進入附睪尾部表達下降，60kDa～70kDa蛋白在附睪頭部、體部、尾部呈逐漸降低，不同分子量的蛋白，表達趨勢不同，推測其在各部位起的作用不同，總體來說附睪頭部蛋白表達量高，而體部、尾部降低。綜合分析這些結(jié)果，提示巖藻糖化聚糖主要在附睪頭部表達，而精子成熟主要發(fā)生在附睪頭部，推測其主要的生物學功能在附睪頭部發(fā)揮，與精子在附睪頭部成熟

7、密切相關(guān)。 (二)RT-PCR技術(shù)對青春期(5周、7周、11周)、成年期(6個月)、衰老期(400天)小鼠睪丸、附睪中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶．廳腑的表達分析顯示：futl、fut4在不同發(fā)育周期附睪頭部、體部及尾部表達趨勢基本一致，青春期表達低、成年期表達量最高、衰老期后表達下降，呈現(xiàn)隨年齡變化波動趨勢，這與生長發(fā)育各階段激素變化相一致，表明基因表達受激素調(diào)控。力矽在不同發(fā)育周期附睪頭部、尾部表達無明顯變化趨勢，而在不同發(fā)育周期的附睪體

8、部表達呈趨勢變化，即在青春期有表達，在成年期表達至高峰，進入衰老期表達下降，說明其可能在附睪體部發(fā)揮功效，其表達同樣受激素調(diào)控。 (三)免疫組化技術(shù)檢測不同發(fā)育時期(3周、5周、7周、成熟期)小鼠睪丸、附睪中Le<'X>和Le<'Y>表達發(fā)現(xiàn)：附睪頭部Le<'X>和Le<'Y>表達3周齡鼠弱，5周齡、7周齡以及進入成年期逐漸增多；附睪體部Le<'X>表達3周齡弱，7周齡強，成年期減弱；而Le<'Y>在5周齡表達較強。附睪尾部Le

9、<'X>和Le<'Y>表達情況基本一致，則在3周齡表達強，隨著生長發(fā)育進入各周期表達漸弱。3周齡鼠附睪上皮細胞處于分化期，附睪頭部、體部、尾部細胞差異不明顯，均以分泌Le<'X>和Le<'Y>細胞為主，Le<'X>和Le<'Y>表達在各部位沒有明顯的區(qū)域性差異。5周、7周齡鼠附睪上皮細胞處于增生期，附睪頭部、體部細胞進一步分化，附睪頭部、體部表達強，呈現(xiàn)一定程度的區(qū)域差異；成年鼠附睪上皮細胞分化完成，附睪頭部、體部和尾部細胞表現(xiàn)出明顯差