應(yīng)用新型熒光顯微技術(shù)研究循環(huán)癌細(xì)胞和TGF-β在成纖維細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、第一部分應(yīng)用活體流式細(xì)胞儀技術(shù)研究前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及巨噬細(xì)胞對(duì)循環(huán)前列腺癌細(xì)胞的作用
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的多步驟過程，也是導(dǎo)致癌癥患者低存活率的原因。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞首先需要脫離腫瘤的原發(fā)灶，然后侵入周圍的血管或淋巴管中，隨著血液或淋巴液遷移到體內(nèi)的其他區(qū)域并進(jìn)一步形成轉(zhuǎn)移灶。由于血液循環(huán)系統(tǒng)貫穿全身，所以通過血循環(huán)的癌細(xì)胞可能在身體的任何部位建立新的轉(zhuǎn)移灶。在本研究中，我們使用新興的活體流式細(xì)胞儀技術(shù)來研究前列

2、腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能與其在循環(huán)系統(tǒng)中消逝動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系。活體流式細(xì)胞儀能夠在體地對(duì)小動(dòng)物體內(nèi)的循環(huán)熒光標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目和流動(dòng)特性進(jìn)行檢測(cè)和定量。我們發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的前列腺癌細(xì)胞系PC-3比LNCaP能更快地從循環(huán)系統(tǒng)中消逝。在尾靜脈注射前列腺癌細(xì)胞后的第1小時(shí)的時(shí)刻，超過70％的PC-3從循環(huán)中消逝了，相比之下，只有不到30％的LNCaP從循環(huán)中消逝了。激光共聚焦顯微成像顯示，在注射前列腺癌細(xì)胞后的第1和第5小時(shí)的時(shí)刻，小鼠顱骨下的骨

3、髓區(qū)域中的DiD標(biāo)記PC-3數(shù)量明顯多于DiD標(biāo)記LNCaP細(xì)胞。前列腺癌細(xì)胞的小鼠動(dòng)力學(xué)差異可能會(huì)為我們研究前列腺癌的早期轉(zhuǎn)移提供新的視角。
　　巨噬細(xì)胞可能直接參與腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，但目前人們對(duì)巨噬細(xì)胞是如何影響循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程尚不完全清楚。我們利用活體流式細(xì)胞儀研究了循環(huán)前列腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的消逝過程，以及通過脂質(zhì)體包裹的氯膦酸二鈉清除巨噬細(xì)胞后的循環(huán)前列腺癌細(xì)胞消逝動(dòng)力學(xué)的改變情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在巨噬細(xì)胞被清除的小

4、鼠（實(shí)驗(yàn)組）和正常小鼠（對(duì)照組）中分別通過尾靜脈注射前列腺癌細(xì)胞PC-3后，循環(huán)PC-3細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的消逝動(dòng)力學(xué)是不同的。相比對(duì)照組，巨噬細(xì)胞被清除的實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)的循環(huán)PC-3細(xì)胞在血液循環(huán)中的消逝速度較慢。該消逝動(dòng)力學(xué)的差異意味著清除巨噬細(xì)胞將有助于前列腺癌細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中停留更長(zhǎng)的時(shí)間。此外，通過體外成像實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可以捕獲，吞噬和消化PC-3細(xì)胞。因此，巨噬細(xì)胞的吞噬作用可能是導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞的消逝動(dòng)力學(xué)改變的一

5、個(gè)重要原因。我們的方法對(duì)研究小動(dòng)物模型中的巨噬細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系有重要裨益。
　　第二部分應(yīng)用雙光子熒光顯微成像技術(shù)和生物圖像信息學(xué)方法研究膠原蛋白支架中成纖維細(xì)胞的TGF-β分子信號(hào)通路
　　為了進(jìn)一步學(xué)習(xí)新的熒光顯微成像技術(shù)，本人受國(guó)家留學(xué)基金委的資助，于2010年11月開始，前往世界著名學(xué)府美國(guó)麻省理工學(xué)院的Peter T.C.So教授實(shí)驗(yàn)室，開展了為期18個(gè)月的科學(xué)研究。
　　細(xì)胞通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)

6、反應(yīng)和各種小分子來感受外界環(huán)境并作出相應(yīng)反應(yīng)。目前大部分細(xì)胞信號(hào)通路知識(shí)都是通過經(jīng)典的生化和遺傳學(xué)操作得來的，但是隨著所研究生物系統(tǒng)的復(fù)雜性不斷增加，要求人們開辟更多新方法來研究細(xì)胞通路并加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。雙光子熒光顯微成像技術(shù)具有高分辨率、穿透能力強(qiáng)、光損傷小的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛地應(yīng)用于生物活細(xì)胞和組織的長(zhǎng)時(shí)間三維成像。生物圖像信息學(xué)方法通過綜合細(xì)胞的基因操作，大規(guī)模成像，圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)來研究細(xì)胞中復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而揭示相關(guān)的生理過

7、程及藥理作用機(jī)制。生物圖像信息學(xué)現(xiàn)已被用于研究培養(yǎng)在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)皿中的細(xì)胞的生物問題。
　　成纖維細(xì)胞在傷口愈合和許多纖維化的疾病中起重要作用。TGF-β調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化過程并影響細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，TGF-β誘導(dǎo)的信號(hào)通路會(huì)影響傷口牽拉和瘢痕形成，進(jìn)而顯著影響受傷器官中傷口愈合的效果。多孔膠原蛋白支架作為組織的細(xì)胞外基質(zhì)類似物被成功應(yīng)用在臨床上對(duì)受傷器官進(jìn)行誘導(dǎo)性再生過程。我們通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA對(duì)成

8、纖維細(xì)胞的TGF-β/SMAD信號(hào)通路中的各個(gè)成分進(jìn)行干擾，并應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室搭建的16-通道光譜多（雙）光子熒光顯微鏡，結(jié)合新的針對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)三維系統(tǒng)的生物圖像信息學(xué)方法，來研究植于多孔膠原蛋白支架中的成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞過程中TGF-β信號(hào)通路。
　　通過對(duì)成纖維細(xì)胞的基于單細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞-多孔膠原蛋白支架系統(tǒng)的雙光子熒光顯微成像數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析，并通過生化免疫印跡實(shí)驗(yàn)作為輔助驗(yàn)證手段，我們推斷出:相對(duì)于TGF

9、-β3，TGF-β1在介導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞過程中發(fā)揮著更重要的作用;SMAD1和SMAD3在TGF-β1介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用;SMAD1和SMAD3是通過不同的方式在TGF-β1介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞過程中發(fā)揮作用的。這些推測(cè)與其他文獻(xiàn)中通過生化或遺傳方法得到的結(jié)果是非常吻合的。因此，我們這里所建立的基于雙光子熒光顯微成像技術(shù)和生物圖像信息學(xué)方法能很好地應(yīng)用于研究細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（