慢性炎癥相關(guān)因素對(duì)AFG1誘導(dǎo)肺腺癌的影響及可能機(jī)制研究.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，具有較強(qiáng)致癌性，1993年被IARC列為“A級(jí)可能人類致癌物”。AF除了與肝癌發(fā)生密切相關(guān)外，呼吸道也是其重要致癌靶點(diǎn)。大量研究證實(shí)經(jīng)呼吸道或經(jīng)飲食途徑攝入AF可以誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素G1(AFG1)是河北省南部腫瘤高發(fā)區(qū)日常食品主要污染的真菌毒素之一。長(zhǎng)期口服AFG1可以誘導(dǎo)NIH小鼠發(fā)生肺腺癌，其腫瘤細(xì)胞來(lái)源于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞

2、（AT-Ⅱ）。外源性致癌物煙草、石棉通過(guò)誘導(dǎo)肺部慢性炎癥導(dǎo)致肺癌發(fā)生，是目前比較公認(rèn)的致癌途徑之一。炎癥反應(yīng)長(zhǎng)期遷延，在肺組織局部形成慢性炎癥微環(huán)境，可以造成靶細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞突變、增殖以及血管增生等改變，從而促進(jìn)靶細(xì)胞惡性增殖和肺癌的發(fā)生發(fā)展。大量文獻(xiàn)報(bào)道AT-Ⅱ是包括AFB1在內(nèi)多種致癌物誘導(dǎo)肺腺癌的靶細(xì)胞，在肺癌發(fā)生中具有重要作用。肺組織炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ與免疫調(diào)控相關(guān)表型發(fā)生改變，如上調(diào)MHC-Ⅱ，增加COX-2表達(dá)，

3、分泌免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，進(jìn)而誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，刺激外周幼稚T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分化，促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展。此外，慢性炎癥反應(yīng)可能加劇了靶細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)DNA損傷，在細(xì)胞癌變的啟動(dòng)階段發(fā)揮重要作用。因此肺組織炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞發(fā)生改變，可能在AFG1誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生中起重要作用。
　　本研究室最近研究發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)一次性給予AFG1后，大鼠肺部出現(xiàn)一過(guò)性炎癥改變和AT-Ⅱ細(xì)胞

4、損傷。但是，AFG1是否能誘導(dǎo)慢性炎癥產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致肺癌發(fā)生并未明了。如若AFG1誘導(dǎo)肺部慢性炎癥反應(yīng)，是否誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞上與免疫調(diào)控相關(guān)的表型發(fā)生改變？是否誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷尚不清楚。研究經(jīng)口長(zhǎng)期給予AFG1對(duì)肺組織炎癥反應(yīng)的影響，并探討其對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞的影響及機(jī)制，對(duì)揭示AFG1致肺癌機(jī)制具有重要意義。
　　本研究旨在明確長(zhǎng)期灌胃AFG1對(duì)肺部炎癥反應(yīng)的影響，及其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用;探討AFG1誘導(dǎo)的慢性炎

5、癥反應(yīng)對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞表型及功能的影響，以及對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)共分三部分，第一部分觀察長(zhǎng)期灌胃AFG1后，Balb/c小鼠肺部是否發(fā)生了慢性炎癥反應(yīng)，及其在肺癌發(fā)生中的作用;第二部分:體外培養(yǎng)具有人AT-Ⅱ細(xì)胞特征的A549細(xì)胞和原代分離培養(yǎng)的人正常AT-Ⅱ細(xì)胞，探討AFG1對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟的影響;給予TNF-α和AFG1共同作用模擬AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，探討其對(duì)A549細(xì)胞表型改變和細(xì)胞因子分泌功能的影

6、響及機(jī)制;第三部分探討TNF-α和AFG1共同作用，對(duì)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響及其可能作用機(jī)制。通過(guò)以上三個(gè)部分從體內(nèi)到體外的研究，探討AFG1致肺癌的可能作用及其作用機(jī)制，豐富人們對(duì)黃曲霉素致癌性的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步做好食品衛(wèi)生安全防控提供理論依據(jù)和合理處置位點(diǎn)。
　　第一部分長(zhǎng)期灌胃黃曲霉毒素G1誘導(dǎo)慢性肺部炎癥并促進(jìn)肺腺癌發(fā)生作用的研究
　　目的:探討長(zhǎng)期灌胃黃曲霉毒素G1對(duì)Balb/c小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響，及其

7、在肺腺癌發(fā)生中的作用。
　　方法:1按照我研究組前期灌胃AFG1誘導(dǎo)NIH小鼠肺腺癌的動(dòng)物造模方法，經(jīng)口給予Balb/c小鼠灌胃AFG16個(gè)月（每周3次），停止灌胃AFG1。2在灌胃1周和1、3、6個(gè)月后隨機(jī)各取4只動(dòng)物處死，采用常規(guī)HE染色和IHC染色觀察小鼠肺組織炎癥反應(yīng)以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況;以及炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子和NF-κB和JAK/STAT3信號(hào)通路激活的情況。3采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)、IHC

8、染色和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法檢測(cè)炎癥模型小鼠肺組織中主要炎癥相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)情況。4觀察灌胃AFG1小鼠肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖變化，以及血管生成情況。5采用IHC染色和Western Blot方法檢測(cè)灌胃AFG1小鼠肺組織中氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志蛋白SOD-2和HO-1表達(dá)情況;以及COX-2的表達(dá)情況。6其余動(dòng)物在灌胃6個(gè)月后停止灌胃AFG1，繼續(xù)飼養(yǎng)6個(gè)月，共1年后觀察肺腫瘤發(fā)生情況以及炎癥相關(guān)信

9、號(hào)通路和COX-2的表達(dá)情況，進(jìn)一步評(píng)估AFG1誘導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)是否介導(dǎo)肺腺癌的發(fā)生。
　　結(jié)果:
　　1灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠生物學(xué)行為的影響
　　在AFG1灌胃、及灌胃后延長(zhǎng)生存共12個(gè)月的觀察期間，兩組小鼠均無(wú)病亡，生長(zhǎng)及生活狀態(tài)無(wú)差異，均未出現(xiàn)臨床疾病表現(xiàn)。
　　2灌胃AFG1期間Balb/c小鼠肺部組織病理學(xué)改變
　　隨著AFG1灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，處理組小鼠較對(duì)照組小鼠出現(xiàn)明顯的肺部慢性炎癥

10、反應(yīng)，細(xì)胞增殖，3-6個(gè)月時(shí)達(dá)高峰。HE染色表現(xiàn)為:肺泡壁增厚，間隔增寬，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡上皮增生。IHC染色顯示，浸潤(rùn)細(xì)胞以CD68+的肺泡巨噬細(xì)胞和CD3+的淋巴細(xì)胞為主，主要定位于肺泡囊壁部位。提示長(zhǎng)期口服AFG1主要造成肺泡壁慢性炎癥反應(yīng)。
　　3灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠肺組織中主要炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)水平的影響
　　隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，處理組小鼠較對(duì)照組小鼠肺組織中TNF-α、 IL-6、IL-

11、1β、MCP-1/CCL-2、MIP-2/CXCL-2、CXCL-1的mRNA表達(dá)水平增高(P＜0.05)，TNF-α在AFG1處理組小鼠肺組織切片的肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)，蛋白表達(dá)水平增高。
　　4灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠肺組織中NF-κB p65和STAT3信號(hào)通路的影響
　　IHC染色顯示，NF-κB p65和P-STAT3在AFG1處理組小鼠肺組織的肺泡上皮細(xì)胞和炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞核中的表達(dá)水平較對(duì)照組

12、升高(P＜0.05)。提示口服AFG1可以激活肺組織NF-κB p65和STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　5灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠肺組織中氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響
　　IHC染色結(jié)果顯示，AFG1處理組小鼠肺組織中氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志蛋白SOD-2和HO-1陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，AFG1處理組小鼠肺組織中SOD-2的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P＜0.05)。提示口服AFG1可以誘導(dǎo)Balb

13、/c小鼠肺組織中出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。
　　6灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠肺組織中細(xì)胞增殖和血管生成的影響
　　IHC染色可見(jiàn)，AFG1處理組小鼠的肺組織中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組升高(P＜0.05)，且集中于肺泡壁和肺泡間隔部位，沿肺泡間隔走行;這些部位肺組織中SP-C陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增多(P＜0.05)，與Ki67表達(dá)平行，增生細(xì)胞中未見(jiàn)CC-10陽(yáng)性表達(dá)。提示AFG1可以誘導(dǎo)主要來(lái)源于AT-Ⅱ的細(xì)胞增殖。
　　W

14、estern blot結(jié)果顯示，AFG1處理組小鼠肺組織中VEGF的蛋白水平較對(duì)照組升高(P＜0.05)。IHC染色可以觀察到AFG1處理組小鼠的肺組織中VEGF陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組增多。免疫熒光染色可見(jiàn)AFG1處理組小鼠肺組織中CD34表達(dá)較對(duì)照組升高。提示口服AFG1誘導(dǎo)的肺部慢性炎癥組織中血管增生活躍，微血管密度增加。
　　7灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠肺泡上皮細(xì)胞中COX-2表達(dá)水平的影響
　　IHC染色觀察，可見(jiàn)AF

15、G1處理組小鼠的肺泡上皮細(xì)胞中COX-2陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較對(duì)照組增多。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AFG1處理組小鼠肺組織中COX-2的蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)。提示在AFG1誘導(dǎo)的肺部慢性炎癥組織中，肺泡上皮細(xì)胞中的COX-2表達(dá)水平上調(diào)。
　　8長(zhǎng)期灌胃AFG1對(duì)Balb/c小鼠肺組織中炎癥相關(guān)性腫瘤形成的影響
　　連續(xù)給予AFG1處理6個(gè)月基礎(chǔ)上，繼續(xù)喂養(yǎng)6個(gè)月。12個(gè)月后，肺組織切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)15

16、只實(shí)驗(yàn)組小鼠中，8只小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡上皮不典型增生病灶或肺腺癌（各4只），對(duì)照組中小鼠未見(jiàn)到不典型增生或肺腺癌。IHC染色顯示，在不典型增生病灶和肺腺癌組織中，Ki67和SP-C陽(yáng)性表達(dá)，CC-10未表達(dá)，提示AT-Ⅱ細(xì)胞異常增殖參與肺腺癌的發(fā)生;IHC染色顯示NF-κB p65、P-STAT3和COX-2在肺腺癌細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)。這些結(jié)果提示AFG1誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)可能在肺腺癌發(fā)生中起重要作用。
　　第二部分黃曲霉素G1和腫瘤壞

17、死因子α協(xié)同作用對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表型的影響及作用
　　目的:炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ表型發(fā)生改變:如上調(diào)MHC-Ⅱ和COX-2表達(dá)，促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)外周幼稚T淋巴細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，抑制肺部免疫反應(yīng)，促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展。因?yàn)樵诘谝徊糠种形覀儼l(fā)現(xiàn)在AFG1灌胃小鼠肺組織中，COX-2在AT-Ⅱ細(xì)胞中高表達(dá)，推測(cè)AFG1誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)可能誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞表型改變而發(fā)揮免疫抑制作用。所以我

18、們進(jìn)一步在整體水平觀察在AFG1誘導(dǎo)的肺慢性炎癥反應(yīng)和肺腺癌中AT-Ⅱ細(xì)胞表型分子表達(dá)情況，及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，評(píng)估AT-Ⅱ細(xì)胞表型改變與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。為了探討AFG1誘導(dǎo)的肺慢性炎癥反應(yīng)影響AT-Ⅱ細(xì)胞表型改變機(jī)制，我們給予AFG1和TNF-α共同作用A549細(xì)胞，體外模擬黃曲霉素G1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，探討AFG1和TNF-α對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞表型的影響及機(jī)制。
　　方法:1采用第一部分的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，IHC染色觀察A

19、FG1誘導(dǎo)的慢性肺炎和肺腺癌組織中MHC-Ⅱ，CD74和FoxP3的表達(dá)情況，探討AT-Ⅱ細(xì)胞表型改變與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。2采用分離培養(yǎng)人AT-Ⅱ細(xì)胞和具有人AT-Ⅱ特征的A549細(xì)胞，F(xiàn)CM方法檢測(cè)其表面HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)情況，探討AFG1單獨(dú)作用對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟的影響。3在第一部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)灌胃AFG1能上調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，TNF-α作為其中核心細(xì)胞因子，在mRNA和蛋白水平上表達(dá)明顯增高，

20、所以我們給予AFG1和TNF-α聯(lián)合作用于A549細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞表面HLA-DR，CD54，COX-2表達(dá)的影響。4探討p38和NF-κB通路在AFG1和TNF-α聯(lián)合作用影響AT-Ⅱ細(xì)胞表型改變中的作用。5采用Real-time PCR方法探討AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1 MHC-Ⅱ，CD74和FoxP3在AFG1誘導(dǎo)的慢性肺炎和肺腺癌組織中的表

21、達(dá)情況
　　IHC染色觀察，可見(jiàn)在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥肺組織和肺腺癌組織里，肺泡上皮細(xì)胞中IA/IE、CD74陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，局部浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和鄰近淋巴結(jié)中FoxP3表達(dá)增高。說(shuō)明AFG1誘導(dǎo)慢性肺炎可能促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子高表達(dá)和肺組織Treg細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果提示AT-Ⅱ細(xì)胞上調(diào)MHC-Ⅱ表達(dá)可能促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，在AFG1誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)的肺腺癌發(fā)生中發(fā)揮作用。
　　2 AFG1對(duì)A549細(xì)胞表型改變的

22、影響及可能機(jī)制
　　內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)表明，AFG1處理可以降低A549細(xì)胞吞噬能力，誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞成熟。FCM檢測(cè)結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組相比，AFG1處理后A549細(xì)胞表面HLA-DR、CD54表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，但是缺失CD80和CD86的表達(dá)。提示AFG1處理可能誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟，發(fā)揮抗原遞呈功能，但由于缺乏有效激活效應(yīng)性T細(xì)胞所必需的共刺激因子表達(dá)，這種成熟AT-Ⅱ細(xì)胞不能激活CD4+T細(xì)胞。p38信號(hào)通路可能在

23、AFG1誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟，上調(diào)HLA-DR和CD54表達(dá)中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3 AFG1對(duì)原代分離培養(yǎng)的AT-Ⅱ細(xì)胞表面HLA-DR、CD80和CD86表達(dá)的影響
　　FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，給予AFG1處理后，原代AT-Ⅱ細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而CD80和CD86仍缺失表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明AFG1促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟，但是缺乏CD86和CD80的表達(dá)，其在抗原遞呈中不能激活CD

24、4+T細(xì)胞。
　　4 AFG1+TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞HLA-DR和CD54表達(dá)的影響
　　FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，與AFG1單獨(dú)處理組相比，AFG1+TNF-α聯(lián)合作用明顯增加了HLA-DR和CD54的表達(dá)(P＜0.05)。提示在AFG1誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境中，TNF-α可以與AFG1協(xié)同作用促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟。
　　5 AFG1和TNF-α協(xié)同作用引起A549細(xì)胞表型改變可能的機(jī)制
　　Western

25、 Blot結(jié)果顯示，AFG1和TNF-α共同作用可以提前激活p38信號(hào)通路(P＜0.05)，并激活NF-κB信號(hào)通路，但是AFG1單獨(dú)作用不激活NF-κB通路。提示在AFG1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，TNF-α激活NF-κB可能發(fā)揮重要作用。FCM結(jié)果表明，PDTC和SB203580預(yù)處理都可以抑制AFG1+TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的HLA-DR和CD54表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。提示在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥微環(huán)境中，AFG1和TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用

26、激活p38通路，TNF-α單獨(dú)激活NF-κB通路，共同調(diào)節(jié)AT-Ⅱ細(xì)胞發(fā)生表型改變。
　　6 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞中COX-2表達(dá)的影響及可能途徑
　　Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，單獨(dú)給予TNF-α可以上調(diào)COX-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)，單獨(dú)給予AFG1對(duì)COX-2表達(dá)無(wú)影響，AFG1+TNF-α處理較單用TNF-α處理可以顯著增加COX-2表達(dá)水

27、平(P＜0.05)。PDTC預(yù)處理抑制了COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而SB203580預(yù)處理對(duì)COX-2表達(dá)無(wú)影響。在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥微環(huán)境中，TNF-α-NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮核心作用，促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞高表達(dá)COX-2。
　　7 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響及可能途徑
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，AFG1單獨(dú)處理可以增加A549細(xì)胞中TNF-α、T

28、GF-β、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和MCP-1的mRNA表達(dá)(P＜0.05，F(xiàn)ig6 A)，而對(duì)MIP-2沒(méi)有影響;AFG1+TNF-α明顯發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步上調(diào)TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1和MIP-2的表達(dá)，其表達(dá)水平明顯高于AFG1單獨(dú)處理組(P＜0.05，F(xiàn)ig7 A)。提示AFG1和TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用，誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞上調(diào)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，而AFG1獨(dú)自激活A(yù)T-Ⅱ細(xì)胞上調(diào)TGF-β

29、表達(dá)，參與肺部炎癥反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫耐受。
　　TNF-α單獨(dú)激活NF-κB通路或和AFG1協(xié)同激活的p38通路共同發(fā)揮作用，調(diào)控AT-Ⅱ細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1和MIP-2以及炎癥抑制因子IL-10;但是TNF-α對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞分泌TGF-β沒(méi)有影響。而AFG1獨(dú)自激活p38信號(hào)通路調(diào)控AT-Ⅱ細(xì)胞表達(dá)TGF-β。提示AFG1誘導(dǎo)的慢性肺炎，可能通過(guò)激活NF-κB和p38信號(hào)通路誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞上調(diào)炎癥相

30、關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)和免疫耐受。AT-Ⅱ細(xì)胞高表達(dá)IL-10和TGF-β，可能進(jìn)一步支持表型改變的AT-Ⅱ細(xì)胞促進(jìn)Treg的活化。
　　綜合以上結(jié)果表明，在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥環(huán)境中，AT-Ⅱ細(xì)胞表型發(fā)生改變:HLA-DR、CD54和COX-2表達(dá)上調(diào)，免疫抑制性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10分泌增加，但缺失CD80和CD86表達(dá)。TNF-α激活NF-κB信號(hào)通路或是聯(lián)合AFG1激活p38通路在這一表型改變中發(fā)揮重要

31、作用。這種表型改變的AT-Ⅱ細(xì)胞可能發(fā)揮免疫抑制功能，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，抑制對(duì)AFG1誘發(fā)腫瘤的免疫監(jiān)視功能，促進(jìn)了肺腺癌發(fā)展。
　　第三部分黃曲霉素G1和腫瘤壞死因子α協(xié)同作用對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的:第一部分研究發(fā)現(xiàn)在AFG1誘導(dǎo)的肺組織慢性炎癥反應(yīng)中，肺泡壁上皮細(xì)胞高表達(dá)氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志蛋白SOD-2和HO-1，推測(cè)AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致AT-Ⅱ細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷

32、。本部分進(jìn)一步給予AFG1和TNF-α共同作用A549細(xì)胞，體外模擬黃曲霉素G1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，探討AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法:1 FCM方法檢測(cè)AFG1處理對(duì)A549細(xì)胞中活性氧生成的影響。2采用堿性彗星實(shí)驗(yàn)和Western blot方法檢測(cè)AFG1對(duì)A549細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷的影響。3采用FCM和Western Blot方法觀察AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激

33、損傷的影響。4 Real time PCR和Western Blot方法檢測(cè)AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞中Cyp450酶活性的影響。
　　5 Western Blot方法觀察NF-κB信號(hào)通路在AFG1和TNF-α聯(lián)合作用誘導(dǎo)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1 AFG1處理對(duì)A549細(xì)胞中活性氧生成的影響
　　FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，AFG1處理組中DCF和DHE的平均熒光強(qiáng)度高于

34、對(duì)照組（P＜0.05），且平均熒光強(qiáng)度的水平隨著AFG1濃度的增加而增加。NAC預(yù)處理后，DCF和DHE的升高水平明顯降低，與未經(jīng)預(yù)處理的AFG1處理組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示AFG1可以提高A549細(xì)胞中ROS的水平。
　　2 AFG1對(duì)A549細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷的影響
　　堿性彗星實(shí)驗(yàn)顯示，AFG1處理組細(xì)胞電泳后出現(xiàn)了“彗星”現(xiàn)象，彗星拖尾明顯;NAC預(yù)處理后，“彗星”現(xiàn)象明顯減少。Western

35、Blot結(jié)果表明，AFG1作用A549細(xì)胞24 h，γ-H2AX蛋白表達(dá)增加，該作用可被NAC預(yù)處理抑制(P＜0.05)。提示AFG1可以誘導(dǎo)A549氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞DNA雙鏈斷裂。
　　3 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響
　　FCM和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，與AFG1單獨(dú)作用相比，TNF-α和AFG1聯(lián)合作用可以更早引起A549細(xì)胞中ROS產(chǎn)生增多(P＜0.05);γ-H2

36、AX和SOD-2的蛋白表達(dá)水平較AFG1單獨(dú)處理組也明顯增高(P＜0.05)。AFG1單獨(dú)作用對(duì)SOD-2表達(dá)沒(méi)有影響。說(shuō)明TNF-α與AFG1聯(lián)合作用可以加速A549細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，TNF-α可以促進(jìn)AFG1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加DNA雙鏈斷裂損傷。
　　4 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞中Cyp450酶活性的影響
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，Cyp2A13在AFG1、TNF-α單獨(dú)作用，或聯(lián)合

37、作用時(shí)表達(dá)水平均明顯增高，Cyp2A13在聯(lián)合作用組的表達(dá)明顯高于在AFG1單獨(dú)處理組(P＜0.05);Cyp2A6在AFG1單獨(dú)作用時(shí)表達(dá)變化不大，TNF-α與AFG1聯(lián)合作用可以明顯增加Cyp2A6的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。Western Blot方法檢測(cè)了Cyp2A13的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果與mRNA的表達(dá)情況一致。這表明TNF-α與AFG1可以協(xié)同作用上調(diào)Cyp2A13和Cyp2A6的表達(dá)，促進(jìn)AFG1在A549細(xì)胞中代

38、謝活化，可能在加劇A549細(xì)胞DNA損傷中發(fā)揮重要作用。
　　5 NF-κB信號(hào)通路在AFG1和TNF-α聯(lián)合作用誘導(dǎo)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合處理組中NF-κB p65蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)增高，且可被PDTC預(yù)處理有效抑制(P＜0.05)。給予PDTC預(yù)處理后，聯(lián)合處理組中Cyp2A13和γ-H2AX的蛋白表達(dá)明顯低于未經(jīng)PDTC預(yù)處理的聯(lián)合作用組(P＜0.05)。表明A

39、FG1和TNF-α聯(lián)合作用可能是通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)Cyp2A13表達(dá)，促進(jìn)AFG1代謝活化，進(jìn)而加重細(xì)胞的DAN雙鏈斷裂損傷。
　　綜上所述，我們認(rèn)為在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)中，除了AFG1本身可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷外，TNF-α與AFG1可以相互促進(jìn)發(fā)揮協(xié)同作用，激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)Cyp2A13表達(dá)，促進(jìn)AFG1代謝活化，進(jìn)一步提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇細(xì)胞的DNA損傷，進(jìn)而增加細(xì)胞突變幾率

40、。
　　結(jié)論:
　　1灌胃AFG1可以誘導(dǎo)Balb/c小鼠出現(xiàn)肺部慢性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為增加炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子釋放，激活NF-κB和STAT3信號(hào)通路，上調(diào)COX-2表達(dá)，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖活躍，血管增生。
　　2在AFG1誘導(dǎo)的肺組織慢性炎癥反應(yīng)中，起核心作用的炎癥細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)明顯增高，可能在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　3延長(zhǎng)灌胃AFG1誘導(dǎo)肺部慢性炎癥模型中

41、小鼠的存活期，小鼠肺部出現(xiàn)AT-Ⅱ細(xì)胞來(lái)源的不典型增生病灶和肺腺癌。肺腺癌組織中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物NF-κB，P-STAT3和COX-2表達(dá)增高。提示AFG1誘導(dǎo)肺部慢性炎癥反應(yīng)，提供促進(jìn)腫瘤發(fā)生的微環(huán)境，可能在肺腺癌發(fā)生中起到重要作用。
　　4在AFG1誘導(dǎo)的肺部慢性炎癥和肺腺癌組織中，AT-Ⅱ細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子表達(dá)增高，Treg細(xì)胞浸潤(rùn)增加。提示表型改變的AT-Ⅱ細(xì)胞可能發(fā)揮免疫抑制功能，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞活化，參與肺腺

42、癌的發(fā)生。
　　5 AFG1可以通過(guò)p38信號(hào)通路誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞表型成熟，上調(diào)MHC-Ⅱ和CD54表達(dá)，但共刺激因子(CD80、CD86)低表達(dá)或缺如，這可能導(dǎo)致AT-Ⅱ細(xì)胞不能激活效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞。
　　6 AFG1與TNF-α聯(lián)合作用促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞表型發(fā)生改變:上調(diào)HLA-DR、CD54、COX-2表達(dá)，以及免疫抑制性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10表達(dá)。提示AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致AT-Ⅱ細(xì)胞表型改變，進(jìn)而

43、使其發(fā)揮免疫抑制功能，誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　7 AFG1與TNF-α聯(lián)合作用增加AT-Ⅱ細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA損傷。
　　8 TNF-α通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)Cyp2A13表達(dá)，促進(jìn)AFG1代謝活化，進(jìn)而加劇DNA損傷。結(jié)果表明在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥微環(huán)境中，TNF-α分泌增加，AFG1與TNF-α聯(lián)合作用加劇AT-Ⅱ細(xì)胞的DNA損傷，可能增